DE4446657A1

DE4446657A1 - Diagnostic aid for differentiating between pathogenic and non-pathogenic amoeba

Info

Publication number: DE4446657A1
Application number: DE19944446657
Authority: DE
Inventors: Rolf Prof Dr Horstmann; Justus Dr Schottelius; Hans-Juergen Sievertsen
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1994-12-16
Filing date: 1994-12-16
Publication date: 1996-06-20
Anticipated expiration: 2014-12-17
Also published as: DE4446657C2

Abstract

A diagnostic aid for differentiation between Entamoeba histolytica and Entamoeba dispar in a faeces sample comprises lectins which are able to bind selectively to these amoeba forms.

Description

Die Erfindung betrifft eine Diagnosehilfe zur Differenzierung zwischen Entamoeba histolytica und Entamoeba dispar in einer Faecesprobe sowie ein diagnostisches Nachweisverfahren.The invention relates to a diagnostic aid for differentiation between Entamoeba histolytica and Entamoeba dispar in one Faecesprobe and a diagnostic detection method.

Die Amöbiasis ist eine Infektionskrankheit, die von dem Parasi ten Entamoeba histolytica verursacht und in den meisten Fällen durch Verzehr verunreinigter Nahrung erworben wird. Verbrei tungsgebiete dieser Krankheit sind fast alle tropischen und subtropischen Regionen, wobei es in Mexiko, Südafrika, Indien und Indonesien am häufigsten zu Erkrankungen kommt.Amebiasis is an infectious disease caused by the Parasi Ten Entamoeba causes histolytica and in most cases is acquired by eating contaminated food. Porridge Areas of this disease are almost all tropical and subtropical regions, being in Mexico, South Africa, India and Indonesia is the most common disease.

Die Amöben siedeln sich nach erfolgter Infektion im Dickdarm des Individuums an und können sich dort über Monate vermehren und übertragungsfähige Dauerformen (Zysten) produzieren, die mit dem Stuhl ausgeschieden werden und mit denen sich ggf. ein anderes Individuum infizieren kann. Unter derzeit noch unbekannten Be dingungen werden die Amöben im Darm aggressiv, dringen in die Darmschleimhaut ein und führen zu einer als Amöbenruhr bekannten geschwürigen Dickdarmentzündung. Ferner können die Parasiten über das Blut in andere Organe wie insbesondere die Leber gelan gen und dort zu Abszessen führen. An diesen schwerwiegenden Krankheitsbildern sterben weltweit etwa 50.000 Menschen jähr lich.The amoeba settle in the colon after infection Individual and can multiply there over months and Produce transferable permanent forms (cysts) that with the Chair are excreted and with which, if necessary, another Can infect an individual. Under currently unknown Be conditions, the amoebas in the intestine become aggressive, penetrate into the Intestinal mucosa and lead to what is known as amoebic dysentery ulcerative colon inflammation. Furthermore, the parasites through the blood into other organs, especially the liver and lead to abscesses there. On these serious Disease patterns worldwide annually kill around 50,000 people Lich.

Da eine wirksame medikamentöse Behandlung zur Verfügung steht, vorbeugende medikamentöse Maßnahmen, wie z. B. eine Impfung je doch nicht existieren, kommt es im Hinblick auf die Schwere eines Krankheitsverlaufs entscheidend darauf an, zu welchem Zeitpunkt eine Infektion eines zumeist anfänglich noch symptom freien Individuums diagnostiziert wird.Since effective drug treatment is available, preventive medication, such as B. one vaccination each but do not exist, it comes in terms of gravity of a course of the disease depends crucially on which Time of infection of a symptom, which is usually initially symptomatic free individual is diagnosed.

Kürzlich wurde gefunden, daß es eine Unterart von Entamoeba histolytica gibt, die inzwischen als eigene Art eingestuft und mit Entamoeba dispar bezeichnet wird (Tannich et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 : 5118-5122, 1989; Diamond und Clark, J. Euk. Microbiol. 40 : 340-344, 1993). Dieser Parasit des Dickdarms verursacht zwar keine Krankheitserscheinungen, ist aber mikro skopisch nicht von Entamoeba histolytica zu unterscheiden. Es wird davon ausgegangen, daß von den 500 Millionen Menschen, die weltweit mit den beiden Amöbenarten infiziert sind, 90% Enta moeba dispar und 10% Entamoeba histolytica in sich tragen. Stellt man daher bei einem ansonsten noch symptomfreien Träger mikroskopisch eine Amöbeninfektion fest, muß festgestellt wer den, um welche der beiden Amöbenarten es sich handelt. Liegt eine Infektion mit Entamoeba histolytica vor, ist eine medika mentöse Behandlung unbedingt erforderlich, wohingegen eine In fektion mit Entamoeba dispar keiner Behandlung bedarf.Recently it was found that it is a subspecies of Entamoeba histolytica there, which is now classified as a separate species and is called Entamoeba dispar (Tannich et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 5118-5122, 1989; Diamond and Clark, J. Euk. Microbiol. 40: 340-344, 1993). This colon parasite causes no symptoms, but is micro Skopically indistinguishable from Entamoeba histolytica. It It is assumed that of the 500 million people who are infected worldwide with the two amoeba species, 90% enta carry moeba dispar and 10% Entamoeba histolytica. Therefore, if you have an otherwise symptom-free carrier microscopic an amoeba infection, who must be determined the one of the two amoeba species. Lies infection with Entamoeba histolytica before is a medication mental treatment is absolutely necessary, whereas an In fection with Entamoeba dispar requires no treatment.

Der Unterschied in der Pathogenität zwischen Entamoeba histoly tica und Entamoeba dispar war ursprünglich epidemiologisch auf gefallen, wobei die Unterscheidung zwischen den beiden Formen durch das aufwendige Verfahren der Isoenzymbestimmung erfolgte ("Zymodeme"). Für dieses Verfahren werden die Amöben einige Tage lang im Brutschrank gezüchtet, dann geerntet und lysiert, und der Amöbenextrakt wird durch Elektrophorese und eine enzymati sche Reaktion untersucht (vgl. P.G. Sargeaunt, Parasitology Today, 3 : 40-43, 1987).The difference in pathogenicity between Entamoeba histoly tica and Entamoeba dispar was originally epidemiologically based fallen, making the distinction between the two forms through the complex process of isoenzyme determination ("Zymodeme"). For this procedure, the amoeba are a few days long grown in the incubator, then harvested and lysed, and the amoeba extract is by electrophoresis and an enzymati reaction (see P.G. Sargeaunt, Parasitology Today, 3: 40-43, 1987).

Neuerdings stehen für die Unterscheidung der beiden Amöbenformen auch gentechnische Methoden zur Verfügung. Dieser diagnostische Ansatz erfordert jedoch die relativ aufwendige Durchführung der Polymerase-Kettenreaktion in einem hochspezialisierten Labor, weshalb dieses Verfahren auch aufgrund der hohen Kosten für die Erstellung einer Diagnose nicht weiträumig und insbesondere nicht unter den zumeist primitiven Bedingungen vor Ort angewen det werden kann.Recently, the two types of amoeba have been distinguished genetic engineering methods are also available. This diagnostic However, the approach requires the relatively complex implementation of the Polymerase chain reaction in a highly specialized laboratory, which is why this procedure is also due to the high cost of Diagnosis not extensive and in particular do not use under the mostly primitive conditions on site can be detected.

Ferner sind monoklonale Antikörper entwickelt worden, die spezi fisch an Entamoeba dispar binden (Mirelman et al., Arch. Med. Res., Mexico, 23 : 49-53, 1992). Dieser Antikörper ist zwar als Unterscheidungsmerkmal anwendbar, weist aber die Nachteile auf, aufwendig und teuer in der Herstellung zu sein und lediglich die weniger wichtige und eher harmlose Spezies Entamoeba dispar nachzuweisen, nicht aber die pathogene Art Entamoeba histolyti ca. Bei lichtmikroskopisch positivem Amöbenbefund müßte daher im Rahmen eines Ausschlußverfahrens unter Verwendung der ggf. mit nachweisbaren Markern versehenen Antikörper nachgewiesen werden, ob es sich um die pathogene Amöbenart Entamoeba histolytica handelt.Furthermore, monoclonal antibodies have been developed which are speci tie fish to Entamoeba dispar (Mirelman et al., Arch. Med. Res., Mexico, 23: 49-53, 1992). This antibody is known as Distinguishing feature applicable, but has the disadvantages to be complex and expensive to manufacture and only that less important and more harmless species Entamoeba dispar to be demonstrated, but not the pathogenic species Entamoeba histolyti approx. With light microscopic positive amoeba findings should therefore in Within the framework of an exclusion procedure using the, if necessary, with Antibodies with detectable markers are detected, whether it is the pathogenic amoeba species Entamoeba histolytica acts.

Der vorliegenden Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, eine Vorrichtung sowie ein Verfahren zur einfachen und kosten günstigen Differenzierung der beiden Amöbenformen zur Verfügung zu stellen.The present invention is therefore based on the object a device and a method for simple and cost favorable differentiation of the two amoeba forms available deliver.

Zur Lösung der Aufgabe wird erfindungsgemäß eine Diagnosehilfe zur Differenzierung zwischen Entamoeba histolytica und Entamoeba dispar in einer Faecesprobe gemäß Hauptanspruch sowie ein dia gnostisches Nachweisverfahren gemäß Anspruch 7 vorgeschlagen. Weitere bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung ergeben sich aus den jeweiligen Unteransprüchen. According to the invention, a diagnostic aid is used to achieve the object to differentiate between Entamoeba histolytica and Entamoeba Dispar in a faeces sample according to the main claim as well as a slide Gnostic detection method proposed according to claim 7. Further preferred embodiments of the present invention result from the respective subclaims.

Erfindungsgemäß umfaßt die Diagnosehilfe Lektine, die in der Lage sind, selektiv an Entamoeba histolytica oder Entamoeba dispar zu binden, wobei die selektive Bindung an Entamoeba hi stolytica bevorzugt ist. Die Lektine sind vorzugsweise von der Weinbergschnecke Helix pomatia abgeleitet. In besonders bevor zugten Ausführungsformen sind die Lektine an einen fluoreszie renden Farbstoff, an Latex-Partikel oder an ein Enzym gekoppelt.According to the invention, the diagnostic aid comprises lectins which are used in the Are able to selectively target Entamoeba histolytica or Entamoeba to bind disparately, the selective binding to Entamoeba hi stolytica is preferred. The lectins are preferably of the Edible snail Helix pomatia derived. In especially before Preferred embodiments are the lectins on a fluoreszie dye, coupled to latex particles or to an enzyme.

Bei dem erfindungsgemäßen diagnostischen Verfahren wird die zu untersuchende Faecesprobe mit Lektinen inkubiert, die in der Lage sind, selektiv an Entamoeba histolytica oder Entamoeba dispar zu binden, wobei die selektive Bindung an Entamoeba hi stolytica bevorzugt ist. Anschließend wird der entstandene Kom plex nachgewiesen. Vorzugsweise werden Lektine verwendet, die von den Landschnecken Helix pomatia oder Helix aspersa abgelei tet sind. Die zu untersuchende Faecesprobe kann entweder frisch verwendet oder in einer Lösung zur Konservierung von Darmpara siten für praktisch unbegrenzte Zeit gelagert werden.In the diagnostic method according to the invention, the investigating faeces sample incubated with lectins in the Are able to selectively target Entamoeba histolytica or Entamoeba to bind disparately, the selective binding to Entamoeba hi stolytica is preferred. Then the resulting com plex detected. Lectins are preferably used which stripped from the land snails Helix pomatia or Helix aspersa are. The faeces sample to be examined can either be fresh used or in a solution for the preservation of intestinal para sites can be stored for practically unlimited time.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform des erfindungs gemäßen Verfahrens werden die Lektine an einen fluoreszierenden Farbstoff gekoppelt, und der entstandene Komplex wird vorzugs weise mit Hilfe eines Fluoreszenzmikroskops nachgewiesen. Nach einer weiteren besonders bevorzugten Ausführungsform werden die Lektine an Latex-Partikel gekoppelt, und der entstandene Komplex wird vorzugsweise mit Hilfe eines üblichen Lichtmikroskops nach gewiesen. Nach einer dritten besonders bevorzugten Ausführungs form werden die Lektine an ein Enzym gekoppelt, welches nach Zugabe eines geeigneten Substrats eine Verfärbung hervorruft, wodurch der entstandene Komplex unmittelbar optisch oder mit Hilfe eines Photometers nachgewiesen werden kann.In a particularly preferred embodiment of the invention According to the method, the lectins are attached to a fluorescent Dye coupled, and the resulting complex is preferred detected with the help of a fluorescence microscope. To a further particularly preferred embodiment, the Lectins coupled to latex particles, and the resulting complex is preferably performed using a conventional light microscope pointed. According to a third particularly preferred embodiment the lectins are coupled to an enzyme, which according to Adding a suitable substrate causes discoloration, whereby the resulting complex is immediately optically or with Can be detected with the help of a photometer.

Mit der vorliegenden Erfindung werden bei der diagnostischen Unterscheidung zwischen den Amöbenarten Entamoeba histolytica und Entamoeba dispar erstmalig erfolgreich Lektine eingesetzt. Diese in der Natur vorkommenden und hochspezifisch an bestimmte Kohlenhydrate bindenden Substanzen wurden bereits in den 50er Jahren entdeckt, wobei heute bereits mehrere 100 Lektine mit unterschiedlichen Spezifitäten bekannt sind, vgl. z. B. I.E. Liener, N. Sharon und I.J. Goldstein (Hrsg.): The Lectins, Pro perties, Functions, and Applications in Biology and Medicine, 1986, Academic Press, New York.With the present invention in the diagnostic Differentiation between the amoeba species Entamoeba histolytica and Entamoeba dispar successfully used lectins for the first time. These occur in nature and are highly specific to certain Carbohydrate binding substances were already in the 50s Discovered years ago, with several hundred lectins already included different specificities are known, cf. e.g. B. I.E. Liener, N. Sharon and I.J. Goldstein (ed.): The Lectins, Pro perties, Functions, and Applications in Biology and Medicine, 1986, Academic Press, New York.

Erfindungsgemäß hat man nun überraschenderweise festgestellt, daß die Lektine der Landschnecken Helix pomatia und Helix asper sa selektiv an die Oberfläche von Entamoeba histolytica, nicht aber an die von Entamoeba dispar binden. Ein weiterer Vorteil der Verwendung eines dieser Lektine liegt in ihrer einfachen Gewinnung und der somit kostengünstigen Verwendung.According to the invention, it has now surprisingly been found that the land snail lectins Helix pomatia and Helix asper sa selective to the surface of Entamoeba histolytica, not but tie it to Entamoeba dispar. Another advantage the use of any of these lectins is simple Extraction and thus the inexpensive use.

Die nachfolgenden Beispiele veranschaulichen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung.The following examples illustrate embodiments of the present invention.

example 1

Etwa 1-2 mg einer Stuhlprobe wurden in 50 µl einer 0,9%igen Kochsalzlösung aufgelöst, die 100 µg/ml Fluoreszein-Isothiozya nat-konjugiertes Helix pomatia- bzw. Helix aspersa-Lektin (Sig ma, Deisenhofen, Bundesrepublik Deutschland) enthielt. Anschlie ßend wurde die Probe unter einem Fluoreszenzmikroskop unter sucht. Hierbei stellte sich heraus, daß einzelne Amöbenzellen mit dem fluoreszierenden Farbstoff versehen waren, wodurch eine Infektion mit der Amöbenart Entamoeba histolytica nachgewiesen wurde. Die Abb. 1 zeigt das fluoreszenzmikroskopische Bild von Entamoeba histolytica, die Abb. 2 das entsprechende Bild der apathogenen Entamoeba dispar. About 1-2 mg of a stool sample was dissolved in 50 µl of a 0.9% saline solution containing 100 µg / ml fluorescein-isothiocyanate-conjugated Helix pomatia or Helix aspersa lectin (Sigma, Deisenhofen, Federal Republic of Germany) . The sample was then examined under a fluorescence microscope. It turned out that individual amoeba cells were provided with the fluorescent dye, whereby an infection with the amoeba species Entamoeba histolytica was detected. Fig. 1 shows the fluorescence microscopic image of Entamoeba histolytica, Fig. 2 the corresponding image of the apathogenic Entamoeba dispar.

Example 2

Etwa 1-2 g einer Stuhlprobe wurden in 10 ml Merthiolat-Forma lin-Lösung zur Konservierung von Darmparasiten aufgeschwemmt und aufbewahrt. Zehn Mikroliter dieser Aufschwemmung wurden auf einem Objektträger mit 2 µl einer Suspension von Latex-Partikeln mit einem Durchmesser von 1 µm ("Polybeads" der Fa. Polyscien ces, Eppelheim, BRD) gemischt, an die Helix pomatia- bzw. Helix aspersa-Lektin gekoppelt worden war. Die Probe wurde sofort mit einem Deckglas bedeckt und mit Hilfe eines üblichen Lichtmikro skops untersucht. Die Abb. 3 zeigt das lichtmikroskopische Bild von Entamoeba histolytica, die Abb. 4 das entsprechen de Bild der apathogenen Entamoeba dispar.About 1-2 g of a stool sample were suspended in 10 ml of merthiolate formlin solution for the preservation of intestinal parasites and stored. Ten microliters of this suspension were mixed on a slide with 2 ul of a suspension of latex particles with a diameter of 1 micron ("Polybeads" from Polyscien ces, Eppelheim, FRG), to the Helix pomatia or Helix aspersa lectin had been coupled. The sample was immediately covered with a cover slip and examined using a conventional light microscope. Fig. 3 shows the light microscopic image of Entamoeba histolytica, Fig. 4 the corresponding image of the apathogenic Entamoeba dispar.

Example 3

Etwa 1-2 mg einer Stuhlprobe werden in einem Reaktionsgefäß (Eppendorf-Gefäß, Mikrotiterplatte) in 50 µl einer phosphatge pufferten 0,9%igen Kochsalzlösung aufgelöst, die 100 µg/ml Helix pomatia- bzw. Helix aspersa-Lektin enthält, das an das Enzym Peroxidase (Sigma, Deisenhofen, Bundesrepublik Deutschland) gekoppelt ist. Nach einer Inkubation von 5-10 Minuten bei Raumtemperatur wird die Stuhlprobe dreimal mit 200 µl der phosphatgepufferten 0,9%igen Kochsalzlösung gewaschen und an schließend nach dem üblichen Verfahren mit 50 µl einer zitratge pufferten Lösung von 0,4 g/l 1,2-Phenylendiamin unter Zugabe von 1/1000 Volumen Wasserstoffperoxid versetzt. Bei positivem Nach weis wird im Verlauf weniger Minuten eine Gelbfärbung der Reak tionslösung beobachtet und ggf. im Überstand photometrisch be stimmt.About 1-2 mg of a stool sample are placed in a reaction tube (Eppendorf tube, microtiter plate) in 50 µl of a phosphate buffered 0.9% saline, the 100 µg / ml helix contains pomatia or Helix aspersa lectin that binds to the enzyme Peroxidase (Sigma, Deisenhofen, Federal Republic of Germany) is coupled. After an incubation of 5-10 minutes at The stool sample is three times with 200 µl of room temperature phosphate buffered 0.9% saline and washed on finally using the usual procedure with 50 µl of a citrate buffered solution of 0.4 g / l 1,2-phenylenediamine with the addition of 1/1000 volume of hydrogen peroxide added. If the night is positive The reak becomes yellow in the course of a few minutes tion solution observed and, if necessary, photometrically in the supernatant Right.

Claims

1. Diagnostic aid for differentiating between Entamoeba histo lytica and Entamoeba dispar in a faeces sample, characterized in that it comprises lectins which are able to bind selectively to one of these amoeba forms.

2. Diagnostic aid according to claim 1, characterized in that the lectins are able to selectively target Entamoeba histo tie lytica.

3. Diagnostic aid according to claim 1 or 2, characterized net that the lectins from the land snail Helix pomatia or Helix aspersa are derived.

4. Diagnostic aid according to one of claims 1 to 3, characterized ge indicates that the lectins are fluorescent Dye are coupled.

5. Diagnostic aid according to one of claims 1 to 3, characterized characterized in that the lectins are coupled to latex particles are.

6. Diagnostic aid according to one of claims 1 to 3, characterized characterized in that the lectins are coupled to an enzyme.

7. Procedure for Diagnostic Differentiation Between Entta moeba histolytica and Entamoeba dispar in one faeces sample, characterized in that the faeces sample with lectins incubated that are able to selectively at one of these Bind amoeba forms, and you get the resulting complex proves.

8. The method according to claim 7, characterized in that Lek tines are used that are able to selectively To bind Entamoeba histolytica.

9. The method according to claim 7 or 8, characterized in that lectins are used by the land snails Helix pomatia or Helix aspersa are derived.

10. The method according to any one of claims 7 to 9, characterized records that lectins are used that are attached to a fluo resected dye are coupled, and the origin the complex with the help of a fluorescence microscope points.

11. The method according to any one of claims 7 to 9, characterized records that lectins are used that are on latex parties kel are coupled, and the resulting complex with Using a light microscope.

12. The method according to any one of claims 7 to 9, characterized records that lectins are used that are linked to an enzyme are coupled, and you immediately the resulting complex optically or with the help of a photometer.