CN1942192A - 协同抗炎药物组合物及使用方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供包含分离自啤酒花的还原异α酸(RIAA)和异α酸(IAA)的组合物，其中RIAA和IAA的比例为约3∶1至约1∶10。本发明还提供通过给予组合物而减轻炎症的方法，所述组合物包含分离自啤酒花的还原异α酸(RIAA)和异α酸(IAA)，其中RIAA和IAA的比例为约3∶1至约1∶10。

Description

协同抗炎药物组合物及使用方法
发明背景
本发明涉及包含啤酒花(Humulus lupulus)提取物或其衍生物的药物组合物。本发明还涉及使用包含分离自或衍生自啤酒花的部分的组合物减轻炎症的方法。
前列腺素(PG)是普遍存在的激素，其功能为作为旁分泌和自分泌调节剂在相邻的细胞环境中影响多种生理变化。PG的多种生理作用包括炎症反应如类风湿性关节炎和骨关节炎、血压控制、血小板聚集、引产和疼痛及发热的加重。30年前阿司匹林和其它非甾体镇痛药抑制PG产生的发现将PG合成确定为药物开发的目标。在命名为PGA至PGI的9个不同的化学类别中至少有16种不同的PG。PG是称作类花生酸的含20个碳的化合物大家族的一部分，它们包括前列环素、血栓素和白三烯。取决于存在于特定细胞类型中的下游酶促机制，产生的PG的分布不同。例如，内皮细胞主要产生PGI2，而血小板主要产生TXA2。
花生四烯酸作为所有PG生物合成的基本底物。环氧合酶(前列腺内过氧化物合成酶，EC 1.14.991，COX)催化从花生四烯酸到前列腺素H2(PGH2)的代谢中的限速步骤，前列腺素H2进一步被代谢为不同的前列腺素、前列环素和血栓素A2(参见图1)。在二十世纪九十年代初，已经证实COX以两种同工型存在，通常称作COX-1和COX-2。随后确定COX-1和COX-2蛋白来源于远在鸟类和哺乳动物之前就分开的不同基因。经COX-1和COX-2途径产生的PG是相同的分子，因此具有相同的生物效应。然而COX-1和COX-2可产生独特模式和可变量的类花生酸；因此，在这些同工酶激活方面的相对不同可导致相当不同的生物反应。现在认为COX-1和COX-2在组织分布和调控方面的不同对COX抑制剂的益处和副作用是至关重要的。
通常认为的观点(COX定理)是COX-1在大多数组织中组成性表达，而COX-2是通过前炎性刺激物触发的诱导性酶，前炎性刺激包括体外细胞和体内炎症部位中的促分裂原、细胞因子和细菌性脂多糖(LPS)。主要基于表达上的这些不同，COX-1特征为管家酶，并且认为涉及维持生理功能，例如胃粘膜的细胞保护作用、肾血流的调节和血小板聚集的控制。尽管在脑、肾和胃肠道发现组成性表达，但认为COX-2主要介导炎症。
认为前列腺素(PG)在维持人胃粘膜内环境稳定中发挥重要作用。目前的观点是COX-1负责正常胃粘膜中PG合成以维持胃粘膜内环境稳定，COX-2由正常胃粘膜以低水平表达，在溃疡愈合中、内毒素接触或细胞因子刺激后诱导表达。现在看来COX-1和COX-2在正常胃粘膜中具有重要的生理作用。
通过COX抑制PG产生的化合物已经成为控制疼痛和炎症的重要药物。总地来说，这些活性剂称作非甾体抗炎药(NSAID)，其主要适应症为骨关节炎和类风湿性关节炎。然而，NSAID的应用，尤其是阿司匹林，已经扩展至心血管疾病的预防。在过去的10年中，投入了相当大的努力开发这样的新分子，即它们作为COX-2酶活性的直接抑制剂并推断这些化合物在长期使用中对胃具有较小的刺激作用。
与确定COX-2选择性相关的主要问题(即低胃刺激性)是测定方法学的不同对所得结果能有很大的影响。表1描述的是许多体外测定法的分类，这些体外测定法已经开发用于测试和比较NSAID和天然化合物针对COX-1和COX-2的相对抑制活性。这些测试系统可归类为3组：(1)使用动物酶、动物细胞或细胞系的系统，(2)使用人细胞系或人血小板和单核细胞的测试法，和(3)目前开展的使用人细胞的模型，这些细胞代表NSAID和食物增补剂的抗炎和副作用的靶细胞。一般而言，使用人细胞系或人血小板和单核细胞的模型是现行标准，但是有效的靶细胞模型还没有获得。急需能够评估对胃刺激可能性的人胃细胞系。
所用的酶可以是动物源或人源的，它们可以是天然的或重组的，并且它们可以作为纯化酶在微粒体制剂中或在全细胞测定中使用。其它系统变量包括花生四烯酸的来源。PG合成可从内源性释放的花生四烯酸或外源加入的花生四烯酸来测定。在后一情况下，在不同的实验室使用不同的浓度。
对于COX-2选择性的理想测定法将具有以下特征：(1)使用含有在正常生理控制下表达的人天然酶的全细胞；(2)该细胞还应当是化合物抗炎和副作用的靶细胞；(3)COX-2应当被诱导而不是组成性表达，从而模拟炎症过程；(4)PG合成应当从内源性存储释放的花生四烯酸而不是外源加入的花生四烯酸来测定。
表1用于评价抗炎化合物COX-2选择性的体外测定法的测试系统分类
  I.测试系统
  A动物   B人   C靶标
  酶   酶   人胃粘膜细胞
  细胞   细胞   人软骨细胞
  细胞系   细胞系   人滑膜细胞
  D 其它系统变量1.花生四烯酸的来源-内源或外源2.用于COX-1和COX-2基因复制的多种表达系统3.COX-2诱导剂的存在或不存在4.以不同浓度给予COX-2诱导剂且保持不同的时间段5.与药物或与花生四烯酸一起培养的持续时间6.培养基中蛋白质浓度的变化。
改写自Pairet，M.和van Ryn，J.(1998)Experimental models used to investigatethe differential inhibition of cyclooxygenase-1 and cyclooxygenase-2 by non-steroidalanti-inflammatory drugs.Inflamm.Res 47，Supplement 2S93-S101，并将其引入本文作为参考。
还没有实验室开发出用于COX-2选择性的理想方法。通常用作处方(Rx)和非处方(OTC)产品的完整细胞系统是由William HarveyInstitute开发的人全细胞测定法(Warner等，Proc Natl Acad Sci U S A96：7563-7568(1999))。到目前为止，该测定模式开发出比任何其它系统更多支持临床相关性的数据。然而，对正常胃粘膜中COX-2的组成性表达作用的新研究使重新研究在COX-2不存在下血小板使用对模拟COX-1抑制的相关性成为必要。从血小板研究外推胃毒性不再是正确的分子基础。用于建立环氧合酶抑制剂的可能靶组织毒性的人胃粘膜细胞系的确认代表急需开发安全有效的抗炎剂。
用于治疗炎症的理想制剂将在胃粘膜细胞中抑制COX-2活性和诱导，而不抑制PGE2的合成。然而，常规的非甾体抗炎药缺乏不影响胃PGE2合成的抑制COX-2的特异性，当长期使用时有造成胃肠系统损伤的危险。实际上，甚至最新开发的抗炎药物例如罗非西卜(Vioxx，Merok & Co.，Inc.)和赛利西卜(Celebrex，Pfizer，Inc.)以诱导自发出血和胃溃疡延迟治愈的形式产生不利的胃毒性。
NSAID毒性
已知NSAID造成严重健康问题，包括胃出血和肾损伤。在美国，有超过1300万NSAID经常使用者，每年开出7000万NSAID处方，以及每年售出300亿非处方NSAID片剂。NSAID诱导的疾病造成每年103000人住院就医，估计每年死亡16500人。所有长期NSAID使用者中20％将发展为消化性溃疡。对上胃肠道出血、穿孔或两者均有，NSAID使用者有更大的危险-高3至4倍。具有严重的NSAID诱导并发症的住院治疗患者中81％以前没有胃肠道症状。超过60岁的人群具有明显更高的经历NSAID相关并发症的概率。此外，在美国所有不良药物反应中21％可归咎于NSAID使用。
已表明新的选择性COX-2抑制剂例如赛利西卜和罗非西卜提供比大多数NSAID更安全的选择。然而，最近的研究显示选择性COX-2抑制剂不完全消除胃肠毒性。实际上如果胃肠道发炎或溃疡，COX-2抑制剂处方可能延迟溃疡愈合。
因此，鉴定将特异性抑制或阻止前列腺素通过COX-2合成，而几乎不影响或不影响胃粘膜中PGE2合成的天然化合物制剂将是有用的。该制剂将用于保持关节组织的健康，用于治疗关节炎或其它炎性病症。术语“特异性或选择性COX-2抑制剂”用于指包括相对于COX-1而言选择性抑制COX-2的化合物或化合物的混合物。然而，尽管该意思是指这样算出的选择性将导致较低胃刺激，但是除非在胃细胞中评价测试物质，否则术语“选择性COX-2抑制剂”并不确保对胃肠细胞的安全性。只有在靶组织、炎性细胞或胃粘膜细胞中测试化合物作用才将鉴定出具有低胃刺激可能性的那些药物。
因此，鉴定这样的组合物将是有用的，所述组合物将在炎性细胞中特异性抑制或阻止COX-2酶活性表达，而几乎不影响或不影响胃粘膜中PGE2的合成，使得这些制剂将能被使用而没有胃肠不适。此外，这些制剂应允许在胃中已存在的溃疡病症的愈合。本发明满足该需要并又提供了相关优点。
发明内容
本发明提供包含分离自啤酒花的还原异α酸(RIAA)和异α酸(IAA)的组合物，其中RIAA和IAA的比例为约3∶1至约1∶10。本发明还提供通过给予组合物减轻炎症的方法，所述组合物包含分离自啤酒花的还原异α酸(RIAA)和异α酸(IAA)，其中RIAA和IAA的比例为约3∶1至约1∶10。
附图简述
图1描述诱导环氧合酶-2和通过环氧合酶花生四烯酸代谢为前列腺素以及其它类花生酸。非甾体抗炎药通过直接抑制环氧合酶起作用。
图2显示能从啤酒花获得的部分和化合物的略图。
图3显示分离自或衍生自啤酒花的示例性部分。图3A显示α酸属(AA)和代表性种类葎草酮(R＝-CH2CH2(CH3)2)、类葎草酮(cohumulone)(R＝-CH(CH3)2)和聚葎草酮(adhumulone)(R＝-CH(CH3)CH2CH3)；图3B显示异α酸属(IAA)和代表性种类异葎草酮(R＝-CH2CH(CH3)2)、异类葎草酮(R＝，-CH(CH3)2)和异聚葎草酮(R＝-CH(CH3)CH2CH3)；图3C显示还原异构化异α酸属(RIAA)和代表性种类二氢异葎草酮(R＝-CH2CH(CH3)2)、二氢异类葎草酮(R＝，-CH(CH3)2)和二氢聚葎草酮(R＝-CH(CH3)CH2CH3)；图3D显示四氢异α酸属(THIAA)和代表性种类四氢异葎草酮(R＝-CH2CH(CH3)2)、四氢异类葎草酮((R＝，-CH(CH3)2)和四氢聚葎草酮(R＝-CH(CH3)CH2CH3)；图3E显示六氢异α酸属(HHIAA)和代表性种类六氢异葎草酮(R＝-CH2CH(CH3)2)、六氢异类葎草酮(R＝-CH(CH3)2)和六氢聚葎草酮(R＝-CH(CH3)CH2CH3)。
图4显示计算的组合指数(Combination Index)参数对还原异构化α酸(RIAA)、异构化α酸(IAA)浓度的图示，RIAA∶IAA比例为100∶1(图4A)、10∶1(图4B)、3∶1(图4C)、3∶2(图4D)、1∶1(图4E)、2∶3(图4F)、1∶10(图4G)、1∶100(图4H)。
具体实施方式
本发明提供用于减轻炎症的组合物和方法。特别地，本发明提供协同抑制前列腺素E2(PGE2)的分离自或衍生自啤酒花的组分。该组合物可以用于减轻炎症的方法中。本发明提供用于在患者中预防性和/或治疗性治疗炎症的啤酒花提取物或其衍生物。例如，本发明提供协同抑制炎症的一种或多种分离自或衍生自啤酒花的部分的组合。在特定的实施方案中，本发明提供通过给予协同抑制PGE2的衍生自啤酒花的异α酸和还原异α酸的组合来减轻炎症的方法。
啤酒花衍生物的急性毒性非常低。因此，如果期望，可使用相对高剂量的啤酒花衍生物，而不会由于啤酒花而产生中毒作用。毒性剂量比根据本发明的治疗剂量高非常多。
本文所用的术语“食物增补剂”是指经消耗而影响生理结构或者功能变化的组合物。术语“治疗组合物”是指所给予的治疗或预防疾病或改善疾病相关征候或症状的化合物。
本文所用的术语“有效量”意指达到所选结果所必需的量。所述量可由本领域普通技术人员容易地确定而无需过度试验。
本文所用的术语“基本”意指所指的大部分但不是全部。
本文所用的术语“COX抑制剂”是指能够抑制COX-2酶活性或表达或能够抑制或减轻严重炎性反应严重程度，包括疼痛和肿胀在内的化合物的组合物。
本文所用的术语“衍生物”或“衍生的”物质是指结构上与另一个物质相关并理论上可由其得到的化学物质，即可由另一个物质制备的物质。衍生物可包括经化学反应得到的化合物。制备化合物衍生物的方法是本领域技术人员所公知的。
本文所用的术语“炎性细胞”是指参与对炎性信号例如白细胞介素、肿瘤坏死因子、缓激肽、组胺或者来自细菌的成分应答的前列腺素合成的免疫系统的细胞成员例如B和T淋巴细胞、中性粒细胞或者巨噬细胞。
本文所用的术语“靶细胞”是指其中期望PGE2或其它前列腺素合成受到抑制的细胞群，例如炎症细胞或肿瘤细胞。或者，“非靶细胞”是指其中不期望PGE2或其它前列腺素合成受到抑制的细胞群，例如胃粘膜细胞、神经细胞或肾细胞。
本文所用的术语“啤酒花提取物”是指从以下步骤所得到的固体物质：(1)使啤酒花植物产品接触溶剂，(2)将溶剂和啤酒花植物产品分离，(3)去除溶剂。
本文所用的术语“溶剂”是指具有从啤酒花植物产品提取固体材料的必要特征的水性或有机性质的液体。溶剂的实例包括但不限于水、蒸汽、过热水、甲醇、乙醇、己烷、氯仿、二氯甲烷、液态或超临界CO2、液态N2或这些物质的组合。
本文所用的术语“CO2提取物”是指从将啤酒花植物产品接触于液态或超临界CO2制剂然后去除CO2所得的固体物质。
本文所用的术语“废啤酒花”是指衍生自啤酒花提取物的固体和亲水残余物。
本文所用的术语“α酸”是指总称为葎草酮并可从啤酒花植物产品分离的化合物，包括葎草酮、类葎草酮、聚葎草酮、希鲁酮和isoprehumulone等。
本文所用的术语“异α酸”是指分离自啤酒花植物产品并之后被异构化的化合物。α酸的异构化可经热处理例如沸腾产生。异α酸的实例包括但不限于异葎草酮、异类葎草酮和异聚葎草酮。
本文所用的术语“还原异α酸”是指分离自啤酒花植物产品并之后被异构化和还原的化合物，包括顺式和反式形式。还原异α酸(RIAA)的实例包括但不限于二氢异葎草酮、二氢异类葎草酮和二氢聚葎草酮。
本文所用的术语“四氢异α酸”是指还原异α酸的某一类。四氢异α酸(THIAA)的实例包括但不限于四氢异葎草酮、四氢异类葎草酮和四氢聚葎草酮。
本文所用的术语“六氢异α酸”是指还原异α酸的某一类。六氢异α酸(HHIAA)的实例包括但不限于六氢异葎草酮、六氢异类葎草酮和六氢聚葎草酮。
本文所用的术语“β酸部分”是指总称为蛇麻酮的化合物，包括蛇麻酮、类蛇麻酮、聚蛇麻酮、四氢异葎草酮和六氢类葎草酮等。
本文所用的术语“精油部分”是指组分的复杂混合物，所述组分包括香叶烯、葎草烯、β-石竹烯、十一烷-2-酮和2-甲基-丁-3-烯-醇等。
本文使用的化合物的“缀合物”是指与选自单糖或二糖、氨基酸、硫酸酯、琥珀酸酯、乙酸酯和谷胱甘肽中的成员共价连接或者缀合的化合物。所述单糖或者二糖可以是选自葡萄糖、甘露糖、核糖、半乳糖、鼠李糖、阿拉伯糖、麦芽糖和果糖中的成员。
本发明涉及使用啤酒花提取物来减轻炎症。一种形式或另一种形式的啤酒花提取物可追溯150多年至19世纪早期，当时首次尝试用水和乙醇提取。甚至今天，在欧洲仍可获得醇提物，但占主要地位的提取物是有机溶剂提取物(例如己烷)和(超临界或液态)CO2提取物。(通常在60巴压力和50-10℃下)CO2为液态，并是是相对温和、非极性溶剂，对啤酒花软树脂和油类具有高度特异性。超过临界点，通常在300巴压力和60℃下，CO2兼具有气体和液体的性质，并且是更强的溶剂。表2中比较了各种提取物的组成。
最简单地，啤酒花提取包括研磨、制粒和再研磨啤酒花以分散啤酒花苦味素，使溶剂流过填充柱以收集树脂组分，最后去除溶剂得到完全的或“纯”树脂提取物。
表2啤酒花提取物(百分比w/w)
  组分   啤酒花   有机溶剂   超临界CO2   液态CO2
  总树脂   12-20   15-60   75-90   70-95
  α酸   2-12   8-45   27-55   30-60
  β酸   2-10   8-20   23-33   15-45
  精油   0.5-1.5   0-5   1-5   2-10
  硬树脂   2-4   2-10   5-11   无
  鞣酸   4-10   0.5-5   0.1-5   无
  蜡   1-5   1-20   4-13   0-10
  水   8-12   1-15   1-7   1-5
主要的有机提取剂是强溶剂，并且除几乎所有的啤酒花苦味素成分之外，它们还提取植物色素、角质层蜡、水和水溶性物质。
超临界CO2比有机溶剂更具有选择性，并且提取更少的鞣酸和蜡以及更少的水，并因此提取更少的水溶性成分。它的确提取了一些植物色素像叶绿素，但远远少于有机溶剂所提取的。液态CO2是最具选择性的商业用于啤酒花的溶剂，并因此得到最纯的全树脂和油提取物。它几乎不提取硬树脂或鞣酸，提取非常低的植物蜡水平，不提取植物色素，提取更少的水和水溶性物质。
作为该选择性和更温和溶剂性质的结果，每单位重量啤酒花液态CO2的提取物的绝对收率低于当使用其它提及的溶剂时所提取的。此外，使用液态CO2的α酸收率(89-93％)低于超临界CO2的(91-94％)或有机溶剂的(93-96％)。提取后，有去除溶剂的过程，对于有机溶剂其涉及加热引起挥发。尽管这些，在提取物中仍存在痕量溶剂。然而，去除CO2仅涉及压力释放以使CO2挥发。
如图3所示，啤酒花CO2提取物可被分馏为各组分，包括啤酒花油、β酸和α酸。啤酒花油包括但不限于葎草烯、β-石竹烯、mycrene、法呢烯(famescene)、γ-杜松烯、α-芹子烯和α-杜松烯。β酸包括但不限于蛇麻酮、类蛇麻酮、聚蛇麻酮、四氢异葎草酮和六氢类蛇麻酮，总称为蛇麻酮。β酸可以被异构化和还原。β酸被还原得到四β酸。α酸包括但不限于葎草酮、类葎草酮、聚葎草酮、希鲁酮和isoprehumulone。α酸可被异构化得到异α酸。异α酸可被还原得到还原异α酸、四氢异α酸和六氢异α酸。
Tobe等报道了衍生自啤酒花提取物的葎草酮鉴定为骨吸收抑制剂(Biosci.Biotech.Biochem 61(1)：158-159(1997))。同一小组后来的研究表明葎草酮作用机理为在TNF-α刺激MC3T3，EI细胞后抑制COX-2基因转录(Yamamoto，FEBS Letters 465：103-106(2000))。得出葎草酮的作用与糖皮质素相似，但葎草酮并不通过糖皮质激素受体发挥作用。尽管这些结果确定了在MC3T3细胞(成骨细胞)中葎草酮在基因水平上抑制PGE2合成，但是本领域技术人员将不会假设这些结果将必然在免疫炎症细胞或其它细胞系中发生。如本文所公开的，啤酒花化合物和衍生物在靶细胞和非靶细胞中显示出高度的组织选择性。此外，本发明描述的啤酒花衍生物在结构上不同于α酸葎草酮。
本发明提供包含至少一种分离自或衍生自啤酒花部分的组合物。分离自或衍生自啤酒花的部分的实例包括α酸、异α酸、还原异α酸、四氢异α酸、六氢异α酸、β酸和废啤酒花。分离自或衍生自啤酒花的部分包括但不限于类葎草酮、聚葎草酮、异葎草酮、异类葎草酮、异聚葎草酮、二氢异葎草酮、二氢异类葎草酮、二氢聚葎草酮、四氢异葎草酮、四氢异类葎草酮、四氢聚葎草酮、六氢异葎草酮、六氢异类葎草酮和六氢聚葎草酮。优选的化合物还可以带有取代基，例如卤素、醚和酯。
分离自或衍生自啤酒花的部分的化合物可由以下总属(supragenus)表示：
(总属)，
Figure A20058001183100141
其中R′选自羰基、羟基、OR和OCOR，其中R是烷基；其中R″选自CH(CH3)2、CH2CH(CH3)2和CH(CH3)CH2CH3；且其中R、T、X和Z独立地选自H、F、Cl、Br、I和π轨道，条件是如果R、T、X或Z之一是π轨道，那么相邻的R、T、X或Z也是π轨道，从而形成双键。
在另一个实施方案中，分离自或衍生自啤酒花的部分的化合物可由以下属(genus)表示：
(属A)，
其中R′选自羰基、羟基、OR和OCOR，其中R是烷基；且其中R″选自CH(CH3)2、CH2CH(CH3)2和CH(CH3)CH2CH3。代表性属A结构包括异α酸，例如异葎草酮、异类葎草酮、异聚葎草酮等，以及还原异α酸，例如二氢异葎草酮、二氢异类葎草酮、二氢聚葎草酮和醚或酯缀合物或者该双键的卤代修饰体。
在另一个实施方案中，分离自或衍生自啤酒花的部分的化合物可由以下属表示：
(属B)，
Figure A20058001183100151
其中R′选自羰基、羟基、OR和OCOR，其中R是烷基；且其中R″选自CH(CH3)2、CH2CH(CH3)2和CH(CH3)CH2CH3。代表性属B结构包括四氢异α酸，例如四氢异葎草酮、四氢异类葎草酮和四氢聚葎草酮等，以及六氢异α酸，例如六氢异葎草酮、六氢异类葎草酮和六氢聚葎草酮和醚或酯缀合物。
如图3所示，分离自或衍生自啤酒花成分的化合物的实例包括但不限于葎草酮、类葎草酮、聚葎草酮、异葎草酮、异类葎草酮、异聚葎草酮、二氢异葎草酮、二氢异类葎草酮、二氢聚葎草酮、四氢异葎草酮、四氢异类葎草酮、四氢聚葎草酮、六氢异葎草酮、六氢异类葎草酮和六氢聚葎草酮。所述化合物可以带有取代基，如上式所示。
啤酒花衍生物是在植物中天然存在的已知化合物，并且在食物和饮料中存在。它们可通过本领域已知的提取和处理方法来制备。啤酒花衍生物可直接从植物材料中以任何已知的方式制备。啤酒花衍生物可通过本领域已知的方法纯化，例如通过从含水有机溶剂如含水醇溶液中重结晶。根据药学领域已知的药物修饰方法，可制备啤酒花衍生物的合成修饰体。
另外，根据本发明还提供包含有效量的啤酒花衍生物以及任选药物稀释剂或辅剂的药物组合物。
剂量
此外，根据本发明提供口服剂型的药物制剂，其包含有效量的啤酒花衍生物，用以在胃肠道期望的部位释放活性成分，例如根据已知的制剂技术如缓释片在胃或十二指肠中释放活性成分。另外根据本发明提供包含有效耐受量的啤酒花衍生物的药物组合物。由于其低毒性，可使用高剂量的啤酒花衍生物来产生有用的结果，其取决于所期望的特定作用。
啤酒花衍生物尤其适合于口服给予。因此，啤酒花衍生物可配制供口服使用，即片剂、包衣片剂、糖锭剂、胶囊剂、散剂、颗粒剂和可溶片，以及液体形式例如混悬剂、分散体或溶液剂，任选与另外的活性成分一起。
本发明提供如本文描述的这些药物组合物的制备方法以及如此制备的组合物。该组合物可通过包括将啤酒花衍生物与药学可接受的载体或辅剂，以及任选与镇痛和/抗炎物质和/或其它化合物混合的方法制备。制备药物组合物的方法是本领域技术人员公知的(参见例如Genarro编著，Remington′s Pharmaceutical Sciences，18th ed.，MackPublishing Co.，Easton，Pennsylvania(1990))。
所选择的剂量水平将取决于具体组合物的活性、给药途径、要治疗或预防的病症的严重程度和要治疗的患者的状况和先前病史。不过，开始以低于要达到的期望治疗效果所需的剂量水平给予组合物，并逐渐增加剂量直至达到所期望的效果在现有技术的范围内。如果期望，用于给药的目的，有效的日剂量可分为多次剂量，例如每日二至四次单独剂量。不过，应理解，对任何具体患者的特定剂量将取决于多种因素，包括体重、一般健康状况、饮食、给药时间和途径、与其它组合物的组合，以及要治疗或预防具体病症的严重程度。
如本文所公开的，本发明提供包括单独递送有效量的啤酒花部分、啤酒花化合物或啤酒花衍生物，或与另外的活性成分一起递送的方法。例如本发明的组合物的的日剂量可被配制为每日递送约0.5-约10000mg啤酒花部分，例如α酸、异α酸、还原异α酸、四氢异α酸、六氢异α酸、β酸、废啤酒花或其它啤酒花部分。特别地，组合物的有效日剂量可配制为每日递送约50-约7500mg啤酒花部分，例如α酸、异α酸、还原异α酸、四氢异α酸、六氢异α酸、β酸，废啤酒花或其它啤酒花部分。例如，组合物的有效日剂量可配制为每日递送约100mg-约5000mg，约200mg-约3000mg，约300mg-约2000mg，约500mg-约1000mg啤酒花部分。在一个实施方案中，有效日剂量一日给予一或两次。特定的实施方案提供包含每日约0.5-约500mg异α酸或还原异α酸，例如每日约50-约300mg或约100-约200mg异α酸或还原异α酸的组合物。在另一个实施方案中，本发明提供包含每日约10-约3000mg还原异α酸、四氢异α酸或六氢异α酸，例如每日约50-约2000mg，约100-约1000mg，约200-约750mg或约250-约500mg还原异α酸、四氢异α酸或六氢异α酸的组合物。在另一个特定实施方案中，提供包含每日约50-约7500mg的废啤酒花，例如每日约100-约6000mg，约200-约5000mg，约300-约3000mg，约500-2000mg或约1000-约1500mg废啤酒花。
局部应用实施方案的组合物可包含约0.001-约10重量％啤酒花衍生物，例如约0.01-约5重量％或约0.1-约1重量％。这些组合物可产生约0.0001-约10μM，例如约0.001-约5μM，约0.01-约1μM或约0.1-约0.5μM的分离自或衍生自啤酒花的部分或其缀合物的血清浓度。
在其中一种或多种分离自或衍生自啤酒花的部分组合的本发明的组合物中，一种或多种部分的比例可以改变以优化期望的效果。例如，如本文所公开的，在RAW 264.7巨噬细胞中观察到RIAA和IAA的组合对PGE2的协同抑制(参见实施例6)。RIAA和IAA 3∶1、3∶2、1∶1和1∶10组合分别观察到协同作用。RIAA∶IAA的比例为1∶1和1∶10时分别观察到特别有效的协同作用。本发明提供包含一种或多种协同抑制PGE2的分离自或衍生自啤酒花的部分的组合物。在一个实施方案中，本发明提供有效协同抑制PGE2的量和比例的RIAA和IAA的组合。RIAA和IAA以有效协同抑制PGE2的比例组合，例如，RIAA∶IAA的比例为约3∶1，约3∶2或约1∶1至1∶10，特别是约1∶1，约1∶2，约1∶3，约1∶4，约1∶5，约1∶6约，约1∶7，约1∶8，约1∶9或约1∶10。
制剂
本发明的组合物可以以食物增补剂或治疗组合物的形式给予。如果期望，该组合物可以以合适剂量单元经口服、局部、经皮、经粘膜、肠胃外等给予。饮食应用的组合物可包括多种添加剂例如其它中间代谢的天然成分、维生素和矿物质以及惰性成分如滑石和硬脂酸镁，后者在片剂和胶囊剂的制备中是标准的赋形剂。例如，一个实施方案包括本发明组合物的活性成分和葡糖胺或硫酸软骨素组合。
本文所用的“药学可接受的载体”包括适合给予个体的溶剂、分散介质、包衣、等渗剂和吸收延迟剂、甜味剂等。这些药学可接受的载体可从多种材料制备，所述材料包括但不限于稀释剂、粘合剂、润滑剂、崩解剂、着色剂、填充剂、调味剂、甜味剂和各种材料例如为了制备特定治疗组合物可能需要的缓冲剂和吸附剂。将这些介质和试剂用于药学活性物质中是本领域所熟知的。可以理解，制剂包含与所述活性成分相容的成分。在一个实施方案中，在制剂中包含滑石和硬脂酸镁。已知影响本发明的组合物如块状食物或功能性食品制备的其它成分包括调味剂、糖、氨基糖、蛋白质和/或改性淀粉，以及脂肪和油。
本发明实施方案的食物增补剂、洗剂或治疗组合物可用本领域技术人员公知的任何方式配制。在一个实施方案中，使用本领域现有技术将组合物配制为胶囊或片剂。在胶囊或片剂形式中，对成年人或动物推荐的日剂量可包含于1至6个胶囊或片剂中。所述组合物也可配制为其它常规形式，例如注射溶液剂或混悬剂、喷雾溶液剂或混悬剂、洗剂、口香糖、锭剂、食物或快餐。食物、快餐、口香糖或锭剂可包括任何可消化的成分，包括甜味剂、调味剂、油、淀粉、蛋白质、水果或水果提取物、植物或植物提取物、谷物、动物脂肪或蛋白。因此，本发明的组合物可被配制为谷物食品、快餐例如薄片、块状食品、软糖、可咀嚼糖果或缓慢溶解的锭剂。本发明的组合物可用于治疗基于炎症的疾病，包括急性或慢性的。本发明特别有用的组合物制剂可减轻炎症反应，并因此促进受累组合的痊愈，或阻止对受累组织的进一步损伤。药学可接受的载体也可用于本发明的组合物和制剂中。
例如本发明的组合物可用于治疗个体中的炎症以及用于治疗其它炎症相关病症，例如作为治疗疼痛和头痛的镇痛药，或治疗发热的解热药。本发明的组合物可以用于治疗关节炎，包括但不限于风湿性关节炎、脊椎关节病(spondyloathopathy)、痛风性关节炎、骨关节炎、系统性红斑狼疮和青少年关节炎。
在一个实施方案中，本发明提供包含分离自啤酒花的还原异α酸(RIAA)和异α酸(IAA)的组合物，其中RIAA和IAA的比例为约3∶1至约1∶10。在该组合物中，所述异α酸可以选自异葎草酮、异类葎草酮和异聚葎草酮。所述还原异α酸可以选自二氢异葎草酮、二氢异类葎草酮和二氢聚葎草酮。
本发明还提供通过给予组合物减轻炎症的方法，所述组合物包含分离自啤酒花的还原异α酸(RIAA)和异α酸(IAA)，其中RIAA和IAA的比例为约3∶1至约1∶10。所述异α酸可以选自异葎草酮、异类葎草酮和异聚葎草酮。所述还原异α酸可以选自二氢异葎草酮、二氢异类葎草酮和二氢聚葎草酮。
另外，本发明还提供通过给予至少两种具有下式的属A的化合物减轻炎症的方法：
(属A)，
Figure A20058001183100201
其中R′选自羰基、羟基、OR和OCOR，其中R是烷基；且其中R″选自CH(CH3)2、CH2CH(CH3)2和CH(CH3)CH2CH3，其中所述两种化合物的比例为约10∶1至约1∶10。
除了用于人治疗外，本发明的实施方案还用于治疗其它动物，包括马、狗、猫、鸟、羊、猪等。用于治疗炎症的制剂能抑制COX-2的诱导和活性，而几乎不影响胃粘膜中PGE2的合成。历史上，用于治疗炎症的NSAID缺乏对COX-2抑制而不影响胃粘膜细胞中PGE2的合成的特异性。因此，当长时间使用时，这些药物刺激并损害胃肠系统。这些禁忌症与本发明无关，因此所述制剂可用于长时间使用而有有限的胃病或没有胃病。可通过本领域技术人员可获得的方法来给药，例如通过口服、局部、经皮、经粘膜或肠胃外途径给药。
本发明还提供通过给予分离自啤酒花的异α酸和还原异α酸减轻炎症的方法(参见实施例6)。在炎性细胞模型中，异α酸和还原异α酸的组合协同抑制PGE2合成(实施例6)。
本文所用的“减轻炎症”是指降低、改善或抑制炎症反应。本领域技术人员可以容易地识别与炎症反应相关的征候或症状的减轻。减轻炎症可指降低与炎症相关的征候或症状的严重度以及抑制炎症，使得与炎症相关的症状几乎没有或没有。
如本文所公开的，可以获得各种测定法以证明一种或多种分离自或衍生自啤酒花的部分的效果(参见实施例)。本领域技术人员理解，可使用包括本文例示的那些在内的本领域技术人员公知的各种测定法测定本文公开的分离自或衍生自啤酒花的部分用于减轻炎症的活性。
下列实施例意在用于例示本发明，但不意于限制本发明的范围。
                        实施例1
在刺激和未刺激的鼠巨噬细胞中啤酒花化合物和衍生物对PGE2合成的抑制
概述-本实施例例示在RAW 264.7鼠巨噬细胞模型中啤酒花部分和衍生物抑制COX-2PGE2合成优先于抑制COX-1PGE2合成。
化学品和试剂-细菌脂多糖(LPS；B E.coli 055：B5)来自于Sigma(St.Louis，MO)。啤酒花部分：(1)α啤酒花(1％α酸；AA)，(2)香型啤酒花OE(10％β酸和2％异构化α酸，(3)异啤酒花(异构化α酸；IAA)，(4)β酸溶液(β酸BA)，(5)六啤酒花金(hexahop gold)(六氢异构化α酸；HHIAA)，(6)Redihop(还原异构化α酸；RIAA)，(7)四啤酒花(四氢异α酸THIAA)和(8)废啤酒花均得自Betatech Hops Products(Washington，D.C.，U.S.A.)。废啤酒花用等体积无水乙醇提取两次。在40℃下加热除去乙醇直至仅剩余深褐色残余物为止。该残余物溶于DMSO中用以在RAW 264.7细胞中测试。前列腺素E2 EIA kitMonoclonal购自Cayman Chemical(Ann Arbor，MI)。抗COX-1和抗COX-2兔多克隆抗血清购自Upstate Biotechnology(Lake Placid，NY)；驴抗羊IgG-HRP购自Santa Cruz Biotechnology(Santa Cruz，CA)。热灭活胎牛血清(FBS-HI Cat.#35-011CV)和Dulbeco′s Modification ofEagle′s Medium(DMEM Cat.#10-013CV)购自Mediatech(Hemdon，VA)。除非另外说明，所有标准试剂均得自Sigma(St.Louis，MO)，并是最纯的可商购获得的。
在本实施例中使用的器材包括：OHAS型号#E01140分析天平、Forma型号#F1214生物安全柜(Marietta，Ohio)、0.1-100μL的移液管(VWR，Rochester，NY)、细胞手动计数器(VWR目录号#23609-102，Rochester，NY)、Forma型号#F3210 CO2培养箱(Marietta，Ohio)、血细胞计数器(Hausser型号#1492，Horsham，PA)、Leica型号#DM IL倒置显微镜(Wetzlar，Germany)、PURELAB Plus Water Polishing System(U.S.Filter，Lowell，MA)、4℃冰箱(Forma型号#F3775，Marietta，Ohio)、涡旋混合器(VWR目录号#33994-306，Rochester，NY)和37℃水浴(Shel Lab型号#1203，Cornelius，OR)。
细胞培养-得自the American Type Culture Collection(目录号#TIB-71，Manassas，VA)的RAW 264.7细胞在Dulbecco′s Modificationof Eagle′s Medium(DMEM，Mediatech，Hemdon，VA)中生长，并保持对数生长期。通过向500ml DMEM瓶中加入50mL热灭活的FBS和5mL青霉素/链霉素制得DMEM生长培养基，并在4℃下储存。使用前生长培养基在水浴中暖至37℃。
在实验的第一日，将对数生长期的RAW 264.7细胞以每孔8×104个细胞铺在每孔有0.2mL生长培养基的96孔组织培养板中。在第一日结束(铺板6-8h后)，去除每孔中的100μL生长培养基，并用100μL新鲜培养基替换。
通过将1.0mg LPS溶于1mL DMSO中制备在RAW 264.7细胞中用于诱导COX-2表达的1.0mg/mL LPS储备液。将其涡旋至溶解，并在4℃下储存。使用前将生长培养基在室温下或37℃水浴中融化。
在实验的第二日，将测试物质制备成于DMSO中的1000×储备液。在1.7ml微离心试管中，加入不含FBS的1mL DMEM，用于配制0.05、0.10、0.5和1.0μg/mL的测试浓度。将2μL 1000×DMSO测试物质储备液加入1mL不含FBS培养基中。该试管中含有2倍终浓度的测试物质，并置于培养箱中10分钟以平衡至37℃。
对于与PGE2合成相关的COX-2，从第一日制备的细胞平板的每孔中去除100μL培养基，并用100μL平衡的2×终浓度测试物质替换。然后将细胞培养90分钟。向每个要刺激的细胞孔中加入20μLLPS以达到10ng LPS/mL的终浓度，并且将细胞培养4小时。LPS刺激后，观察细胞的外观，并用基于3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基四唑溴(MTT)的比色测定法(Sigma，St.Louis，MO)评定细胞存活力。将用于测定PGE2取样后，直接向孔中加入MTT溶液。使用ELISA平板读数器在580nm下读每孔的吸光度。对所述化合物中的任何一个化合物的测试最高浓度没有观察到毒性。将来自每孔的25μL上清培养液转移至干净的微离心试管中，以测定释放入培养基中的PGE2。
使用商业、非放射性定量方法(Caymen Chemical，Ann Arbor，MI)测定PGE2，并使用制造商推荐的方法，没有修改。简言之，将25μL的培养基，连同一系列稀释的PGE2标准品，与适量乙酰胆碱酯酶标记的示踪剂和PGE2抗血清混合，并在室温下培养18h。使孔空并用缓冲液冲洗后，加入含有乙酰胆碱酯酶底物的200μL Elhman试剂。反应在室温下于慢速摇床上进行1h，并在415nm处测定吸光度。PGE2浓度以皮克/105细胞表示。
对于与PGE2合成相关的COX-1，从第一日制备的细胞平板的每孔中去除100μL培养基，并用100μL平衡的2×终浓度测试物质替换。然后将细胞培养90分钟。接着，代替LPS刺激，将细胞与100μM花生四烯酸一起培养15分钟。将来自每孔的25μL上清培养液转移至干净的微离心试管中，以测定释放入培养基中的PGE2。观察细胞的外观，并如上述所述测定细胞的存活力。对所述化合物中任何一个化合物测试的最高浓度均没有观察到毒性。将来自每孔的25μL上清培养液转移至干净的微离心试管中，以测定释放入培养基中的PGE2。如上所述测定PGE2并报告。如下所述，计算COX-1和COX-2的PGE2合成的半数抑制浓度(IC50)。
使用CalcuSyn(BIOSOFT，Ferguson，MO)计算PGE2合成的半数抑制浓度(IC50)。使用Chou和Talaly，Adv.Enzyme Regul.22：27-55.(1984)描述的半数效应法，用该统计包进行多药量效计算，该文献在此引入作为参考。
简言之，该分析以最简单的可能形式使“剂量”和“效应”相关联：fa/fu＝(C/Cm)m，其中C是化合物的浓度或剂量，Cm是表示效能的半数有效剂量。从半数效应曲线的X-截距测定Cm。受测试物质浓度影响的部分是fa，而未受浓度影响的部分是fu(fu＝1-fa)。指数m是表示量效曲线S状或形状的参数。其通过半数效应曲线的斜率来估计。
半数效应曲线是x＝log(C)对y＝log(fa/fu)作图，是基于Chou的半数效应方程的对数形式。数据与半数-效应方程的拟合度由半数-效应曲线的直线相关系数r表示。通常，来自酶或受体系统的实验数据r＞0.96，来自组织培养物r＞0.90，来自动物系统r＞0.85。在此处报告的基于细胞的研究中，所有的线性相关系数均大于0.90。实验在三个不同日重复3次。平均3次独立实验的每个剂量的抑制百分比，并且用于计算所报告的半数抑制浓度。
表3在RAW 264.7细胞中啤酒花部分和衍生物的COX-1和COX-2抑制
测试物质   COX-2 IC50[μg/ml]   COX-1 IC50[μg/ml] COX-1 IC50/COX-2 IC50
  属A结构
  异啤酒花(IAA)   0.13   18   144
  Redihop(RIAA)   0.34   29   87
  属B结构
  四啤酒花(THIAA)   0.20   4.0   21
  六啤酒花(HHIAA)   0.29   3.0   11
  α酸
  α啤酒花(AA)   0.21   6.2   30
  其它
  香型啤酒花OE   1.6   4.1   2.6
  β酸(BA)   0.54   29   54
  废啤酒花(EtOH)   0.88   21   24
如表3所示，在这一靶巨噬细胞模型中所有的啤酒花部分和衍生物均相对于COX-1选择性抑制COX-2。这是新的和意想不到的发现。啤酒花衍生物IAA和RIAA对COX-2的选择性程度分别为144倍和87倍，是预料不到的。在这一RAW 264.7细胞模型中，属A的化合物显示比属B的化合物具有更强的COX-2选择性，分别为平均116倍对16倍更强的COX-2抑制。0酸、β酸和废啤酒花也是高选择性COX-2抑制剂，COX-1/COX-2的比例分别为30，54和24。以前还没有报道过其它来源的天然产物有如此高的COX-2选择性和低半数抑制浓度。香型啤酒花的COX-2选择性最低，COX-1/COX-2的比例为2.6。
                    实施例2
在胃粘膜细胞中啤酒花化合物和衍生物对PGE2合成抑制的缺乏
概述-该实施例例示在人AGS胃粘膜细胞系中啤酒花部分对PGE2抑制的缺乏，意味着这些化合物具有低的胃刺激可能性。
使用的化学品和试剂如实施例1中所述。PGE2如前述实施例1中所述进行测定并报告。如实施例1[2]所述计算AGS细胞中PGE2合成的半数抑制浓度(IC50)。
人胃粘膜细胞系AGS得自the American Type Culture Collection(ATCC号CRL-1739；Manassas，VA)，并根据提供者的说明书传代培养。该细胞在37℃和5％CO2下在含有10％FBS、50单位青霉素/mL、50μg链霉素/mL、5％丙酮酸钠和5％L-谷氨酰胺的RPMI1640中常规培养。将指数生长的细胞接种于6孔板中，并生长至融合。将20μL等分部分上清培养液用作测定PGE2含量的样本。然后用PBS冲洗细胞，刮剥并裂解以用于免疫印迹。
表4.在AGS细胞模型中啤酒花衍生物对PGE2合成的半数抑制浓度(IC50)
化合物   AGS IC50[μg/mL]   95％置信区间[μg/mL] r
  α酸
  α啤酒花   17   2.4-124   0.927
  属A结构**
  异α酸
  异啤酒花(IAA)   16   4.9-54   0.970
  Isorich   9.2   1.1-81   0.894
  还原异α酸
  Redihop(RIAA)   21   3.1-145   0.936
  属B结构***
  四异α酸
  四啤酒花(THIAA)   51   6.8-374   0.949
  六异α酸
  六啤酒花(HHIAA)   34   25-47   0.998
  其它
  BetaStab   73   18-291   0.977
  栲胶#4411   59   11-324   0.963
  香型啤酒花   43   21-85   0.992
  #1115(废啤酒花)   35   8.5-141   0.970
  阳性并行对照
  阿司匹林   1.2   (0.37-4.1)   0.950
  历史对照
  阿司匹林   0.52   (0.26-1.0) -
  布洛芬   0.57   (0.27-1.2) -
  罗非西卜   1.8   (0.90-3.7) -
  赛利西卜   0.024   (0.0068-0.082) -
*IC50值根据三次独立测定的平均值计算；将AGS细胞铺于板中并使其达到80％融合。洗涤细胞，并在用A23187处理前60分钟加入测试物质。三十分钟后，将培养基除去以测定PGE2。
AGS细胞模型中啤酒花衍生物对PGE2合成的半数抑制浓度在表4中给出。一般而言，属B结构的抑制作用比属A结构和α酸的抑制作用低。在属B组中，THIAA和HHIAA的IC50值分别为51和34μg/mL。属A组中的IAA、Isorich和RIAA的IC50值分别为16、9.2和21μg/mL，比属B种类的IC50值平均低63％。可以将具有相对高IC50值的啤酒花衍生物BetaStab(73μg/mL)、栲胶#4411(59μg/mL)、香型啤酒花(43μg/mL)和#1115废啤酒花(35μg/mL)归类为对胃粘膜没有刺激。意想不到地，与包括较新的、高选择性的COX-2药物罗非西卜和赛利西卜在内的任何NSAID相比，所有的啤酒花衍生物对AGS胃粘膜细胞具有基本更少的抑制。
                    实施例3
属A和属B啤酒花衍生物在大鼠中的急性毒性
在大鼠中对啤酒花衍生物的急性毒性进行测试。对十个平均体重100g的Fisher 344雄性幼鼠口服给予5000mg测试物质/kg体重并且观察14天；确定死亡的大鼠的数目。通过当口服给予大鼠5000mg测试物质/kg体重时没有致死性，证明了啤酒花衍生物的低急性毒性。
                    实施例4
评价在RAW 264.7细胞中由还原异构化α酸和异构化α酸的组合产生的PGE2协同抑制
本实施例描述了在脂多糖(LPS)刺激的炎症RAW 264.7炎症模型中，还原异构化α酸(RIAA)和异构化α酸(IAA)的组合对前列腺素E2(PGE2)产生的抑制。
在实施例1中描述了在这些实验中所使用的标准器材。化学品和试剂如下获得。细菌脂多糖(LPS；B E.coli 055：B5)来自Sigma(St.Louis，MO)。前列腺素E2单克隆抗体试剂盒购自Cayman Chemical(Ann Arbor，MI)。热灭活胎牛血清(FBS-HI Cat.#35-011CV)和Dulbecco′s Modification of Eagle′s Medium(DMEM Cat#10-1013CV)购自Mediatech(Herndon，VA)。除非另有说明，所有标准试剂均得自Sigma(St.Louis，MO)，并是最纯的可商购获得的。测试物质包括购自Betatech Hops Products(Washington，DC)的RIAA(Redihop(还原异α酸(RIAA)，29.5-30.5％，＜0.2％异α酸)和IAA(异啤酒花(异α酸(IAA)，29.5～30.5％)。
细胞培养和用测试物质处理-RAW 264.7细胞(ATTC号TIB-71)得自the American Type Culture Collection(Manassas，VA)，并根据供应商的说明书进行传代。在为测试的准备中，细胞在含10％FBS-HI生长DMEM培养基中生长，该培养基含青霉素/链霉素，并在实验开始前维持在对数期。在实验的第二日，在96孔组织培养板中以8×104细胞/孔进行细胞铺板，每孔200μL生长培养基。
在37℃和5％CO2下培养过夜后，吸干培养基并用200μL不含胎牛血清(FBS)和青霉素/链霉素的DMEM替换。测试物质溶于二甲亚砜(DMSO)中，为250倍储备液。4μL的该250倍储备液测试物质制剂加入1mL DMSO中，将用于测试物质每个剂量的200μL该溶液一式两份加入各孔中。测试物质的终浓度为10、1、0.1和0.01μg/mL。表5显示用测试物质处理和LPS刺激的RAW 264.7细胞的给药剂量矩阵。
表5用测试物质处理和LPS刺激的RAW 264.7细胞的给药剂量矩阵
化合物 部分 RIAA   d1[μg/mL]   d2[μg/mL]   d3[μg/mL]   d4[μg/mL] 孔数
  1.BetaTech RIAA2.BetaTech IAA3.RIAA∶IAA[100∶1]4.RIAA∶IAA[10∶1]5.RIAA∶IAA[3∶1]6.RIAA∶IAA[3∶2]7.RIAA∶IAA[1∶1]8.RIAA∶IAA[2∶3]9.RIAA∶IAA[1∶10]10.RIAA∶IAA[1∶100]   1.000.000.990.910.750.600.500.400.090.010 RIAA＝IAA＝RIAA＝IAA＝RIAA＝IAA＝RIAA＝IAA＝RIAA＝IAA＝RIAA＝IAA＝RIAA＝IAA＝RIAA＝IAA＝   10.00010.00010.0009.9010.09910.0009.0910.90910.0007.5002.50010.0006.004.0010.0005.005.0010.0004.006.0010.0000.9099.09110.0000.109.90   1.0001.0001.0000.9900.0101.0000.9090.0911.0000.7500.2501.0000.600.401.0000.500.501.0000.400.601.0000.0810.9091.0000.010.99   0.1000.1000.1000.0990.0010.1000.0910.0090.1000.0750.0250.1000.060.040.1000.050.050.1000.040.060.1000.0090.0910.1000.0010.099   0.0100.0100.0100.00990.00010.0100.0090.0010.0100.00750.00250.0100.0060.0040.0100.0050.0050.0100.000.010.0100.0010.0090.0100.00010.0099   8888888888
PGE2的测定-使用商业、非放射性PGE2定量方法(CaymenChemical，Ann Arbor，MI)，并且使用制造商推荐的方法，没有修改。简言之，50μL上清培养基用适当量的乙酰胆碱酯酶标记的示踪剂和PGE2抗血清稀释，并在室温下一起培养18h。之后，使PGE2测定微量滴定板孔腾空并用缓冲液冲洗，然后加入含有乙酰胆碱酯酶底物的200μL Ellman试剂。反应在室温下在慢速摇床上进行1h，并在415nm处在Bio-tek Instruments(型号#Elx800，Winooski，VT)酶联免疫吸附测定(ELISA)平板读数器中测定吸光度。用于该测试法的制造商说明书包括＜10％的测试内变异系数、小于10％的与PGD2和PGF2A的交叉反应性和在10-1000pg mL-1范围内呈线性。如下所述，PGE2浓度以皮克/105细胞计算。
对于与PGE2测定相关的计算，使用CalcuSyn(BIOSOFT，Ferguson，MO)计算PGE2合成的半数抑制浓度(IC50)。使用Chou和Talaly(Adv.Enzyme Regul.22，27-55(1984))描述的半数效应法，用该统计包进行多药量效计算。
简言之，该分析以最简单的可能形式使“剂量”和“效应”相关联：fa/fu＝(C/Cm)m，其中C是化合物的浓度或剂量，Cm是表示效能的半数有效剂量。从半数效应曲线的X-截距测定Cm。受测试物质浓度影响的部分是fa，而未受浓度影响的部分是fu(fu＝1-fa)。指数m是表示量效曲线S状或形状的参数。其通过半数效应曲线的斜率来估计。
半数效应曲线是x＝log(C)对y＝log(fa/fu)作图，是基于Chou的半数效应方程的对数形式。数据与半数-效应方程的拟合度由半数-效应曲线的直线相关系数r表示。通常，来自酶或受体系统的实验数据r＞0.96，来自组织培养物r＞0.90，来自动物系统r＞0.85。在此处报告的基于细胞的研究中，所有的线性相关系数均大于0.90。实验在三个不同日重复至少3次。平均3次独立实验的每个剂量的抑制百分比，并且用于计算所报告的半数抑制浓度。
使用组合指数(CI)参数来定量测试组分的协同作用。Chou-Talaly的CI是基于多重药效，并源于酶动力学模型(Chou和Talalay，J.Biol.Chem.252：6438-6442(1977))。该方程只测定相加作用而不是协同作用或拮抗作用。不过，根据Cho和Talalay，supra，1977的建议，协同作用在该分析中定义为大于预期相加作用，而拮抗作用定义为小于预期相加作用。使用CI＝1表示相加作用，对具有相同作用方式的互相排斥化合物或具有完全独立作用方式的非排斥性化合物，获得以下关系：CI＜1，＝1和＞1，分别表示协同作用、相加作用和拮抗作用。
细胞存活力-在用于PGE测定的培养基加样前或之后即刻，从视觉上检查细胞评价细胞存活力。当观察时，注明细胞死亡率。
对于统计方法，使用CalcuSyn(BIOSOFT，Ferguson，MO)用最小四个浓度(表5)计算剂量-反应曲线和具有95％置信区间的半数抑制浓度(IC50)。使用Chou和Talaly，同上，1984描述的半数效应法，用该统计包进行多药量效计算。所有的剂量-反应数据获得半数抑制浓度(附录B)。当允许时实施两种数据的转换。当最低测试浓度产生的PGE2产量高于在LPS刺激对照的PGE2产量时，第一种转换由从这些最低剂量产生的最高PGE2产量计算抑制百分比组成。该方法调节整个板的反应差异性和梯度。第二种数据转换调整分级剂量反应变异。应用孔间历史差异(histrorical variance)的Monte Carlo模拟法预期当将每浓度复孔用于四点剂量-反应曲线中时，剂量-反应曲线将仅仅在40％的时间上有分级。因此，在计算IC50之前在其中反应没有分级的这些情形中通过浓度进行反应分选。
结果-在该研究中获得的分别为0.24μg/mL(95％置信限(CL)0.060-0.94μg/mL)和0.56μg/mL(95％CL 0.28-1.1)的RIAA和IAA半数抑制浓度(IC50)值与本实验室以前使用LPS-RAW 264.7过夜实验方案的结果一致。
RIAA、IAA和RIAA∶IAA组合对LPS刺激的RAW 264.7细胞的半数抑制浓度以及对每种组合计算的协同区间在表6中给出。令人惊奇地，发现所有的RIAA∶IAA组合都显示出协同作用，尽管在剂量-反应曲线的不同区段上。发现RIAA∶IAA组合为10∶1、1∶1和1∶100的协同区间在剂量-反应曲线的下部，包括RIAA的浓度为2.5×10-8至0.26μg/mL。RIAA∶IAA组合比例为100∶1、3∶1、3∶2、2∶3和1∶10时，在剂量-反应曲线的上端显示协同作用，RIAA的浓度为0.31至68,261μg/mL。因此，可以合理预期RIAA和IAA在体内在宽的剂量范围内均发生协同作用，而不论所给予制剂中各组分的比例。
表6.在LPS刺激的RAW264.7细胞中RIAA、IAA和RIAA∶IAA组合的半数抑制浓度和协同区间。
测试物质 RIAA[％] IC50[μg/mL]   测试物质RIAA[μg/mL]
  RIAAIAARIAA∶IAA[100∶1]RIAA∶IAA[10∶1]RIAA∶IAA[3∶1]RIAA∶IAA[3∶2]RIAA∶IAA[1∶1]RIAA∶IAA[2∶3]RIAA∶IAA[1∶10]RIAA∶IAA [1∶100]   10009991756050409.11.0   0.240.560.680.281.81.10.231.90.770.60 955-556551.1×10-6-0.0708.2-53110-58072.4×10-8-0.26＞11270.31-46611.5×10-8-6.0×10-5
以CI＜1.0定义为协同区间
用LPS刺激前60分钟用测试物质处理HAEC，并培养过夜。LPS刺激后18小时，上清培养液取样用于PGE2测定。从最小四个浓度经两次独立实验计算半数抑制浓度。如上所述计算CI。
图4显示计算的组合指数参数对还原异构化α酸(RIAA)、异构化α酸(IAA)浓度的图示，RIAA∶IAA比例为100∶1(图4A)，10∶1(图4B)，3∶1(图4C)，3∶2(图4D)，1∶1(图4E)，2∶3(图4F)，1∶10(图4G)，1∶100(图4H)。
这些结果显示在四种组合-3∶1、3∶2、1∶1和1∶10中观察到RIAA和IAA之间的协同作用。在RIAA∶IAA比例为1∶1和1∶10时发生特别相关的协同作用。对于这些制剂，分别在RIAA浓度＜0.58μg/mL和RIAA浓度＞0.311μg/mL时观察到协同作用。
本申请全文中参考了多种出版物。为了更充分的描述本发明所属领域的现有技术的水平，这些出版物以其全部内容在此引入本申请作为参考。尽管已经参考以上所提供的实施例对本发明进行了描述，但是应理解在不偏离本发明精神的前提下，可进行各种修改。
权利要求书
(按照条约第19条的修改)
1.一种组合物，其包含分离自啤酒花的还原异α酸(RIAA)和异α酸(IAA)，其中RIAA和IAA的比例为约3∶1至约1∶10，并且其中所述RIAA和IAA各自占所述组合物的至少0.1％。
2.权利要求1的组合物，其中所述异α酸选自异葎草酮、异类葎草酮和异聚葎草酮。
3.权利要求1的组合物，其中所述还原异α酸选自二氢异葎草酮、二氢异类葎草酮和二氢聚葎草酮。
4.一种减轻PGE2介导的炎症的方法，所述方法包括给予包含分离自啤酒花的还原异α酸(RIAA)和异α酸(IAA)的组合物，其中RIAA和IAA的比例为约3∶1至约1∶10，并且其中所述RIAA和IAA各自占所述组合物的至少0.1％。
5.权利要求4的方法，其中所述异α酸选自异葎草酮、异类葎草酮和异聚葎草酮。
6.权利要求4的方法，其中所述还原异α酸选自二氢异葎草酮、二氢异类葎草酮和二氢聚葎草酮。
7.一种减轻PGE2介导的炎症的方法，所述方法包括给予至少两种具有下式的属A的化合物：
(属A)，
其中R′选自羰基、羟基、OR和OCOR，其中R为烷基；且
其中R″选自CH(CH3)2、CH2CH(CH3)2和CH(CH3)CH2CH3，其中所述两种化合物的比例为约10∶1至约1∶10，并且其中所述RIAA和IAA各自占所述组合物的至少0.1％。

Claims (7)

1.一种组合物，其包含分离自啤酒花的还原异α酸(RIAA)和异α酸(IAA)，其中RIAA和IAA的比例为约3∶1至约1∶10。
2.权利要求1的组合物，其中所述异α酸选自异葎草酮、异类葎草酮和异聚葎草酮。
3.权利要求1的组合物，其中所述还原异α酸选自二氢异葎草酮、二氢异类葎草酮和二氢聚葎草酮。
4.一种减轻炎症的方法，所述方法包括给予包含分离自啤酒花的还原异α酸(RIAA)和异α酸(IAA)的组合物，其中RIAA和IAA的比例为约3∶1至约1∶10。
5.权利要求1的方法，其中所述异α酸选自异葎草酮、异类葎草酮和异聚葎草酮。
6.权利要求1的方法，其中所述还原异α酸选自二氢异葎草酮、二氢异类葎草酮和二氢聚葎草酮。
7.一种减轻炎症的方法，所述方法包括给予至少两种具有下式的属A的化合物：
(属A)，
Figure A2005800118310002C1
其中R′选自羰基、羟基、OR和OCOR，其中R为烷基；且
其中R″选自CH(CH3)2、CH2CH(CH3)2和CH(CH3)CH2CH3，其中所述两种化合物的比例为约10∶1至约1∶10。
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