CN106146407A - 杂芳基化合物和其用途 - Google Patents

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尤斯温德·辛格
拉塞尔·彼得
里奇兰德·韦恩·特斯特
阿瑟·F·克卢格
霍尔木兹·马兹迪亚斯尼
威廉姆·弗雷德里克·韦斯特林三世
牛德强
乔立新
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Abstract

本发明涉及杂芳基化合物和其用途，并提供化合物、其医药学上可接受的组合物和其使用方法。

Description

杂芳基化合物和其用途
本申请是申请日为2010年12月29日，申请号为201080060197.8，发明名称为“杂芳基化合物和其用途”的申请的分案申请。
相关申请案的交叉参考
本申请案主张2009年12月29日申请的美国第12/648693号的优先权，所述美国第12/648693号是2009年6月26日申请的美国第12/492,180号的部分接续案，所述美国第12/492,180号主张2008年6月27日申请的美国临时申请案第61/076,450号、2009年1月29日申请的美国临时申请案第61/148,388号和2009年4月20日申请的美国临时申请案第61/170,874号的优先权，各案完整内容以引用的方式并入本文中。
技术领域
本发明涉及适用作蛋白激酶抑制剂的化合物。本发明还提供包含本发明化合物的医药学上可接受的组合物以及使用所述组合物治疗各种病症的方法。
背景技术
近年来，对于与疾病相关的酶和其它生物分子的更深入了解极大促进了对新型治疗剂的研究。一类得到深入研究的重要的酶是蛋白激酶。
蛋白激酶构成了一个负责控制细胞内的多种信号转导过程的结构上相关的酶的大家族。普遍认为，蛋白激酶是由某一共同的祖先基因保留其结构和催化功能进化而来。几乎所有的激酶都含有类似的250到300个氨基酸的催化域。激酶可根据其磷酸化的底物而归类到多个家族中(例如蛋白质-酪氨酸、蛋白质-丝氨酸/苏氨酸、脂质等)。
一般说来，蛋白激酶通过影响磷酰基从三磷酸核苷到信号传导路径中所涉及的蛋白质受体的转移来介导细胞内信号传导。这些磷酸化事件充当可调节或调控目标蛋白质的生物功能的分子开/关的转换器。最终，这些磷酸化事件回应于多种细胞外和其它刺激物而被触发。所述刺激物的实例包括环境和化学应激信号(例如渗透压休克(osmotic shock)、热休克、紫外线照射、细菌内毒素和H2O2)、细胞因子(例如白细胞介素-1(IL-1)和肿瘤坏死因子α(TNF-α))和生长因子(例如粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和成纤维细胞生长因子(FGF))。细胞外刺激物可能会影响与细胞生长、迁移、分化、激素分泌、转录因子活化、肌肉收缩、葡萄糖代谢、蛋白质合成控制和细胞周期调控有关的一种或一种以上细胞反应。
许多疾病都与上文所述的由蛋白激酶介导的事件所触发的异常细胞反应有关。这些疾病包括(但不限于)自体免疫性疾病、发炎性疾病、骨骼疾病、代谢性疾病、神经和神经退化性疾病、癌症、心血管疾病、过敏症和哮喘、阿尔茨海默氏病(Alzheimer's disease)和激素相关性疾病。因此，对于发现适用作治疗剂的蛋白激酶抑制剂仍然存在需要。
发明内容
现已发现，本发明的化合物和其医药学上可接受的组合物可有效用作一种或一种以上蛋白激酶的抑制剂。所述化合物具有通式I-a和I-b：
或其医药学上可接受的盐，其中环A、环B、m、p、Rx、Ry、Rv、W1、W2和R1如本文中所定义。
本发明化合物和其医药学上可接受的组合物适用于治疗与由蛋白激酶介导的事件所触发的异常细胞反应有关的多种疾病、病症或病状。所述疾病、病症或病状包括本文所述者。
本发明提供的化合物也适用于对生物学和病理学现象中的激酶进行研究；研究由这些激酶介导的细胞内信号转导路径；和对新的激酶抑制剂进行比较评估。
附图说明
图1描绘在拉莫斯细胞(Ramos Cell)中化合物I-2对磷酸化磷脂酶cγ2(phospho-plc gamma2，p-plcγ2)的剂量反应抑制；以及在“洗脱(washout)”实验中化合物I-2的结果。
图2描绘在拉莫斯细胞中化合物I-4对p-plcγ2的剂量反应抑制；以及在“洗脱”实验中化合物I-4的结果。
图3描绘在拉莫斯细胞中化合物I-7对p-plcγ2的剂量反应抑制；以及在“洗脱”实验中化合物I-7的结果。
图4描绘在拉莫斯细胞中化合物I-35对p-plcγ2的剂量反应抑制。
图5描绘在拉莫斯细胞中化合物I-38对p-plcγ2的剂量反应抑制。
图6描绘MS分析，其确定TEC激酶的Cys449经化合物I-2共价修饰。
图7描绘MS分析，其确定TEC激酶的Cys449经化合物I-4共价修饰。
图8描绘MS分析，其确定TEC激酶的Cys449经化合物I-7共价修饰。
图9描绘在含有EGFR缺失突变体的HCC827细胞中进行的“洗脱”实验中化合物I-2的结果与在相同“洗脱”实验中化合物I-4和化合物I-7的结果的比较。
图10描绘在含有野生型EGFR的A431细胞中进行的“洗脱”实验中化合物I-7的结果与EGF对照组的结果的比较。
图11描绘MS分析，其确定JAK-3激酶的Cys909经化合物I-7共价修饰。
图12描绘在经IL-2刺激的CTLL-2细胞中化合物I-2对P-Stat5的剂量反应抑制；以及在经IL-2刺激的CTLL-2细胞中化合物I-2对P-JAK-3的剂量反应抑制。
图13描绘在经IL-2刺激的CTLL-2细胞中化合物I-4对P-Stat5的剂量反应抑制；以及在经IL-2刺激的CTLL-2细胞中化合物I-4对P-JAK-3的剂量反应抑制。
图14描绘在经IL-2刺激的CTLL-2细胞中化合物I-7对P-Stat5的剂量反应抑制。
图15描绘MS分析，其确定BTK经化合物I-7共价修饰。
图16描绘蛋白免疫印迹(Western blot)，其显示在用不同量的I-7处理后可供探针化合物I-215利用的BTK蛋白。
图17描绘图16中的蛋白免疫印迹结果的定量。
图18描绘利用化合物I-7和探针化合物I-215进行的洗脱实验的蛋白免疫印迹。
图19描绘图18中的蛋白免疫印迹结果的定量。
图20描绘BTK的氨基酸序列(SEQ ID 1)。
图21描绘TEC的氨基酸序列(SEQ ID 2)。
图22描绘ITK的氨基酸序列(SEQ ID 3)。
图23描绘BMX的氨基酸序列(SEQ ID 4)。
图24描绘TXK的氨基酸序列(SEQ ID 5)。
图25描绘JAK3的氨基酸序列(SEQ ID 6)。
具体实施方式
1.本发明化合物的一般描述
在某些实施例中，本发明提供式I-a或I-b的化合物：
或其医药学上可接受的盐，其中：
环A是任选经取代的选自以下的基团：苯基；3元到7元饱和或部分不饱和碳环；8元到10元双环饱和、部分不饱和或芳基环；具有1到4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的5元到6元单环杂芳基环；具有1到3个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的4元到7元饱和或部分不饱和杂环；具有1到5个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的7元到10元双环饱和或部分不饱和杂环；或具有1到5个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的8元到10元双环杂芳基环；
环B是任选经取代的选自以下的基团：苯基；3元到7元饱和或部分不饱和碳环；8元到10元双环饱和、部分不饱和或芳基环；具有1到4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的5元到6元单环杂芳基环；具有1到3个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的4元到7元饱和或部分不饱和杂环；具有1到5个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的7元到10元双环饱和或部分不饱和杂环；或具有1到5个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的8元到10元双环杂芳基环；
R1是弹头基团(warhead group)；
Ry是氢、卤素、-CN、-CF3、C1-4脂肪族基、C1-4卤代脂肪族基、-OR、-C(O)R或-C(O)N(R)2；
各R基团独立地为氢，或任选经取代的选自以下的基团：C1-6脂肪族基；苯基；具有1到2个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的4元到7元杂环；或具有1到4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的5元到6元单环杂芳基环；
W1和W2各独立地为共价键或二价C1-3亚烷基链，其中W1或W2的一个亚甲基单元任选经-NR2-、-N(R2)C(O)-、-C(O)N(R2)-、-N(R2)SO2-、-SO2N(R2)-、-O-、-C(O)-、-OC(O)-、-C(O)O-、-S-、-SO-或-SO2-置换；
R2是氢、任选经取代的C1-6脂肪族基，或-C(O)R，或：
R2和环A上的取代基与其间的插入原子一起形成4元到6元饱和、部分不饱和或芳香族稠合环，或：
R2和Ry与其间的插入原子一起形成4元到7元部分不饱和或芳香族稠合环；
m和p独立地为0到4；且
Rx和Rv独立地选自-R、卤素、-OR、-O(CH2)qOR、-CN、-NO2、-SO2R、-SO2N(R)2、-SOR、-C(O)R、-CO2R、-C(O)N(R)2、-NRC(O)R、-NRC(O)NR2、-NRSO2R或-N(R)2，其中q为1到4；或：
Rx和R1当同时存在于环B上时，与其间的插入原子一起形成具有0到3个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的5元到7元饱和、部分不饱和或芳基环，其中所述环经弹头基团和0到3个独立地选自氧代基、卤素、-CN或C1-6脂肪族基的基团取代；或
Rv和R1当同时存在于环A上时，与其间的插入原子一起形成具有0到3个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的5元到7元饱和、部分不饱和或芳基环，其中所述环经弹头基团和0到3个独立地选自氧代基、卤素、-CN或C1-6脂肪族基的基团取代。
2.化合物和定义
本发明化合物包括上文大体上描述的化合物，并且将借助本文所揭示的类别、亚类和种类进一步说明。除非另作指示，否则本文中使用的以下定义将适用。出于本发明的目的，化学元素是根据化学与物理学手册(Handbook of Chemistry and Physics)第75版的元素周期表CAS版(Periodic Table of the Elements,CAS version)标识。另外，有机化学的一般原理描述于“有机化学(Organic Chemistry)”,托马斯索瑞尔(Thomas Sorrell),大学科学书籍出版社(University Science Books),索萨利托(Sausalito):1999；和“马氏高等有机化学(March's Advanced Organic Chemistry)”,第5版,M.B.史密斯(Smith,M.B.)和J.马奇(March,J.)编,约翰威立父子出版公司(John Wiley&Sons,Inc.),纽约(NewYork):2001中，所述文献的全部内容都以引用的方式并入本文中。
本文中使用的术语“脂肪族”或“脂肪族基团”是指完全饱和或含有一个或一个以上不饱和单元的直链(即，未分支)或分支链、经取代或未经取代的烃链，或者是指完全饱和或含有一个或一个以上不饱和单元但不为芳香族基团的单环烃或双环烃(在本文中也称为“碳环”“环脂肪族基”或“环烷基”)，所述脂肪族基团具有单一连接点连接到分子的剩余部分。除非另作说明，否则脂肪族基团含有1到6个脂肪族碳原子。在一些实施例中，脂肪族基团含有1到5个脂肪族碳原子。在其它实施例中，脂肪族基团含有1到4个脂肪族碳原子。在其它实施例中，脂肪族基团含有1到3个脂肪族碳原子，而在其它实施例中，脂肪族基团含有1到2个脂肪族碳原子。在一些实施例中，“环脂肪族基”(或“碳环”或“环烷基”)是指单环C3-C6烃，其完全饱和或含有一个或一个以上不饱和单元但不为芳香族基团，且其具有单一连接点连接到分子的剩余部分。适合的脂肪族基团包括(但不限于)线性或分支链、经取代或未经取代的烷基、烯基、炔基以及其混合物，例如(环烷基)烷基、(环烯基)烷基或(环烷基)烯基。
术语“低碳数烷基”是指C1-4直链或分支链烷基。例示性低碳数烷基为甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基和叔丁基。
术语“低碳数卤烷基”是指经一个或一个以上卤素原子取代的C1-4直链或分支链烷基。
术语“杂原子”是指氧、硫、氮、磷或硅中的一者或多者(包括氮、硫、磷或硅的任何氧化形式；任何碱性氮的季铵化形式或；杂环中的可取代氮，例如N(如在3,4-二氢-2H-吡咯基中)、NH(如在吡咯烷中)或NR+(如在N-经取代的吡咯烷基中))。
本文使用的术语“不饱和”是指部分具有一个或一个以上不饱和单元。
本文使用的术语“二价C1-8(或C1-6)饱和或不饱和、直链或分支链烃链”是指如本文所定义的直链或分支链二价亚烷基、亚烯基和亚炔基链。
术语“亚烷基”是指二价烷基。“亚烷基链”为聚亚甲基，即-(CH2)n-，其中n为正整数，优选为1到6、1到4、1到3、1到2或2到3。经取代亚烷基链是一个或一个以上亚甲基氢原子经取代基置换的聚亚甲基。适合的取代基包括下文关于经取代脂肪族基团所述的取代基。
术语“亚烯基”是指二价烯基。经取代亚烯基链为一个或一个以上氢原子经取代基置换的含有至少一个双键的聚亚甲基。适合的取代基包括下文关于经取代脂肪族基团所述的取代基。
本文使用的术语“亚环丙基”是指具有以下结构的二价环丙基：
术语“卤素”是指F、Cl、Br或I。
术语“芳基”可单独使用，或如在“芳烷基”、“芳烷氧基”或“芳氧基烷基”中作为较大部分的一部分使用，是指总共具有5到14个环成员的单环和双环系统，其中所述系统中的至少一个环是芳香族环，且其中所述系统中的各环含有3到7个环成员。术语“芳基”可与术语“芳基环”互换使用。在本发明的某些实施例中，“芳基”是指芳香族环系统，其包括(但不限于)苯基、联苯、萘基、蒽基等，其可带有一个或一个以上取代基。在本文中所使用的术语“芳基”的范围内还包括芳香族环与一个或一个以上非芳香族环稠合的基团，例如茚满基、邻苯二甲酰亚胺基、萘甲酰亚胺基、菲啶基或四氢萘基等。
术语“杂芳基”和“杂芳-”可单独使用，或作为例如“杂芳烷基”或“杂芳烷氧基”等较大部分的一部分使用，是指具有5到10个环原子，优选5、6或9个环原子；环阵列中共享6、10或14个π电子；且除碳原子外还具有1到5个杂原子的基团。术语“杂原子”是指氮、氧或硫，并且包括氮或硫的任何氧化形式以及碱性氮的任何季铵化形式。杂芳基包括(但不限于)噻吩基、呋喃基、吡咯基、咪唑基、吡唑基、三唑基、四唑基、噁唑基、异噁唑基、噁二唑基、噻唑基、异噻唑基、噻二唑基、吡啶基、哒嗪基、嘧啶基、吡嗪基、吲哚嗪基、嘌呤基、萘啶基和蝶啶基。本文使用的术语“杂芳基”和“杂芳-”还包括杂芳香族环与一个或一个以上芳基环、环脂肪族环或杂环基环稠合的基团，其中连接基团或连接点在杂芳香族环上。非限制性实例包括吲哚基、异吲哚基、苯并噻吩基、苯并呋喃基、二苯并呋喃基、吲唑基、苯并咪唑基、苯并噻唑基、喹啉基、异喹啉基、噌啉基、酞嗪基、喹唑啉基、喹喔啉基、4H-喹嗪基、咔唑基、吖啶基、吩嗪基、吩噻嗪基、吩噁嗪基、四氢喹啉基、四氢异喹啉基和吡啶并[2,3-b]-1,4-噁嗪-3(4H)-酮。杂芳基可以是单环或双环。术语“杂芳基”可与术语“杂芳基环”、“杂芳基基团”或“杂芳香族基”互换使用，这些术语中的任一者包括任选经取代的环。术语“杂芳烷基”是指经杂芳基取代的烷基，其中烷基和杂芳基部分独立地任选经取代。
本文使用的术语“杂环”、“杂环基”、“杂环基团”和“杂环状环”可互换使用，并且指饱和或部分不饱和且除碳原子外还具有一个或一个以上、优选1到4个如上文所定义的杂原子的稳定5元到7元单环或7元到10元双环杂环部分。当在提到杂环的环原子时使用时，术语“氮”包括经取代的氮。举例来说，在具有0到3个选自氧、硫或氮的杂原子的饱和或部分不饱和环中，所述氮可为N(如在3,4-二氢-2H-吡咯基中)、NH(如在吡咯烷基中)或+NR(如在N-经取代的吡咯烷基中)。
杂环可在产生稳定结构的任何杂原子或碳原子处连接到其侧基，并且任何环原子都可任选经取代。所述饱和或部分不饱和杂环基团的实例包括(但不限于)四氢呋喃基、四氢噻吩基、吡咯烷基、哌啶基、吡咯啉基、四氢喹啉基、四氢异喹啉基、十氢喹啉基、噁唑烷基、哌嗪基、二噁烷基、二氧戊环基、二氮杂卓基、氧氮杂卓基、硫氮杂卓基、吗啉基和奎宁环基。术语“杂环”、“杂环基”、“杂环基环”、“杂环基团”和“杂环部分”在本文中可互换使用，并且也包括杂环基环与一个或一个以上芳基环、杂芳基环或环脂肪族环稠合的基团，例如吲哚啉基、3H-吲哚基、色满基、菲啶基或四氢喹啉基，其中连接基团或连接点在杂环基环上。杂环基可以是单环或双环。术语“杂环基烷基”是指经杂环基取代的烷基，其中烷基和杂环基部分独立地任选经取代。
本文使用的术语“部分不饱和”是指环部分包括至少一个双键或三键。术语“部分不饱和”打算涵盖具有多个不饱和位点的环，但不打算包括如本文所定义的芳基或杂芳基部分。
如本文所述，本发明化合物可含有“任选经取代的”部分。一般来说，无论在术语“经取代”之前是否存在术语“任选”，术语“经取代”都是指指定部分的一个或一个以上氢经适当取代基置换。除非另作指示，否则“任选经取代的”基团可在所述基团的各可取代位置处具有适当取代基，并且当任何指定结构中的多于一个位置可经多于一个选自指定群组的取代基取代时，每一位置的取代基可相同或不同。本发明所设想的取代基的组合优选为导致形成稳定或化学上可行的化合物的取代基组合。本文使用的术语“稳定”是指当出于本文所揭示的一个或一个以上目的而使化合物经受允许其制备、检测且在某些实施例中允许其回收、纯化和使用的条件时所述化合物实质上不改变。
“任选经取代的”基团的可取代碳原子上的适当单价取代基独立地为卤素；-(CH2)0-4R°；-(CH2)0-4OR°；-O(CH2)0-4R°；-O-(CH2)0-4C(O)OR°；-(CH2)0-4CH(ORo)2；-(CH2)0- 4SR°；-(CH2)0-4Ph，其可经R°取代；-(CH2)0-4O(CH2)0-1Ph，其可经R°取代；-CH＝CHPh，其可经R°取代；-(CH2)0-4O(CH2)0-1-吡啶基，其可经R°取代；-NO2；-CN；-N3；-(CH2)0-4N(R°)2；-(CH2)0-4N(R°)C(O)R°；-N(R°)C(S)R°；-(CH2)0-4N(R°)C(O)NR°2；-N(R°)C(S)NR°2；-(CH2)0-4N(R°)C(O)OR°；-N(R°)N(R°)C(O)R°；-N(R°)N(R°)C(O)NR°2；-N(R°)N(R°)C(O)OR°；-(CH2)0-4C(O)R°；-C(S)R°；-(CH2)0-4C(O)ORo；-(CH2)0-4C(O)SR°；-(CH2)0-4C(O)OSiR°3；-(CH2)0-4OC(O)R°；-OC(O)(CH2)0-4SR°、SC(S)SR°；-(CH2)0-4SC(O)R°；-(CH2)0-4C(O)NR°2；-C(S)NR°2；-C(S)SR°；-SC(S)SR°,-(CH2)0-4OC(O)NR°2；-C(O)N(OR°)R°；-C(O)C(O)R°；-C(O)CH2C(O)R°；-C(NOR°)R°；-(CH2)0-4SSR°；-(CH2)0-4S(O)2Ro；-(CH2)0-4S(O)2OR°；-(CH2)0-4OS(O)2R°；-S(O)2NR°2；-(CH2)0-4S(O)R°；-N(R°)S(O)2NR°2；-N(R°)S(O)2R°；-N(OR°)R°；-C(NH)NR°2；-P(O)2R°；-P(O)R°2；-OP(O)R°2；-OP(O)(OR°)2；SiR°3；-(C1-4直链或分支链亚烷基)O-N(R°)2；或-(C1-4直链或分支链亚烷基)C(O)O-N(R°)2，其中各R°可如下文所定义经取代且独立地为氢、C1-6脂肪族基、-CH2Ph、-O(CH2)0-1Ph、-CH2-(5元到6元杂芳基环)，或具有0到4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的5元到6元饱和、部分不饱和或芳基环，或者，尽管上文给出定义，但两个独立出现的R°与其间的插入原子一起形成具有0到4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的3元到12元饱和、部分不饱和或芳基单环或双环，其可如下文所定义经取代。
R°(或通过将两个独立出现的R°与其间的插入原子连在一起所形成的环)上的适当单价取代基独立地为卤素、-(CH2)0-2R●、-(卤基R●)、-(CH2)0-2OH、-(CH2)0-2OR●、-(CH2)0- 2CH(OR●)2、-O(卤基R●)、-CN、-N3、-(CH2)0-2C(O)R●、-(CH2)0-2C(O)OH、-(CH2)0-2C(O)OR●、-(CH2)0-2SR●、-(CH2)0-2SH、-(CH2)0-2NH2、-(CH2)0-2NHR●、-(CH2)0-2NR● 2、-NO2、-SiR● 3、-OSiR● 3、-C(O)SR●、-(C1-4直链或分支链亚烷基)C(O)OR●或-SSR●，其中各R●未经取代，或在之前具有“卤基”的情况下仅经一个或一个以上卤素取代，且其独立地选自C1-4脂肪族基、-CH2Ph、-O(CH2)0-1Ph，或具有0到4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的5元到6元饱和、部分不饱和或芳基环。R°的饱和碳原子上的适当二价取代基包括＝O和＝S。
“任选经取代的”基团的饱和碳原子上的适当二价取代基包括以下：＝O、＝S、＝NNR* 2、＝NNHC(O)R*、＝NNHC(O)OR*、＝NNHS(O)2R*、＝NR*、＝NOR*、-O(C(R* 2))2-3O-或-S(C(R* 2))2-3S-，其中R*在每次独立出现时是选自氢、可如下文所定义经取代的C1-6脂肪族基，或具有0到4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的未经取代的5元到6元饱和、部分不饱和或芳基环。结合于“任选经取代的”基团的邻位可取代碳的适当二价取代基包括：-O(CR* 2)2-3O-，其中R*在每次独立出现时是选自氢、可如下文所定义经取代的C1-6脂肪族基，或具有0到4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的未经取代的5元到6元饱和、部分不饱和或芳基环。
R*的脂肪族基团上的适当取代基包括卤素、-R●、-(卤基R●)、-OH、-OR●、-O(卤基R●)、-CN、-C(O)OH、-C(O)OR●、-NH2、-NHR●、-NR● 2或-NO2，其中各R●未经取代，或在之前具有“卤基”的情况下仅经一个或一个以上卤素取代，且其独立地为C1-4脂肪族基、-CH2Ph、-O(CH2)0-1Ph，或具有0到4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的5元到6元饱和、部分不饱和或芳基环。
“任选经取代的”基团的可取代氮上的适当取代基包括 或其中各独立地为氢、可如下文所定义经取代的C1-6脂肪族基、未经取代的-OPh，或具有0到4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的未经取代的5元到6元饱和、部分不饱和或芳基环，或者，尽管上文给出定义，但两个独立出现的与其间的插入原子一起形成具有0到4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的未经取代的3元到12元饱和、部分不饱和或芳基单环或双环。
的脂肪族基团上的适当取代基独立地为卤素、-R●、-(卤基R●)、-OH、-OR●、-O(卤基R●)、-CN、-C(O)OH、-C(O)OR●、-NH2、-NHR●、-NR● 2或-NO2，其中各R●未经取代，或在之前具有“卤基”的情况下仅经一个或一个以上卤素取代，且其独立地为C1-4脂肪族基、-CH2Ph、-O(CH2)0-1Ph，或具有0到4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的5元到6元饱和、部分不饱和或芳基环。
本文使用的术语“医药学上可接受的盐”是指在合理医学判断的范围内，适于与人类和低等动物组织接触使用而无不当毒性、刺激、过敏反应等且与合理的效益/风险比相称的盐。医药学上可接受的盐在所属领域中众所周知。举例来说，S.M.伯格(S.M.Berge)等人于药物科学杂志(J.Pharmaceutical Sciences),1977,66,1-19中详细描述了医药学上可接受的盐；所述文献是以引用的方式并入本文中。本发明化合物的医药学上可接受的盐包括衍生自适当无机和有机酸和碱的盐。医药学上可接受的无毒酸加成盐的实例为氨基与例如盐酸、氢溴酸、磷酸、硫酸和高氯酸等无机酸或与例如乙酸、草酸、马来酸、酒石酸、柠檬酸、琥珀酸或丙二酸等有机酸所形成的盐，或通过使用例如离子交换法等所属领域中使用的其它方法形成的盐。其它医药学上可接受的盐包括己二酸盐、藻酸盐、抗坏血酸盐、天冬氨酸盐、苯磺酸盐、苯甲酸盐、硫酸氢盐、硼酸盐、丁酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、柠檬酸盐、环戊烷丙酸盐、二葡糖酸盐、十二烷基硫酸盐、乙烷磺酸盐、甲酸盐、富马酸盐、葡庚糖酸盐、甘油磷酸盐、葡糖酸盐、半硫酸盐、庚酸盐、己酸盐、氢碘化物、2-羟基-乙烷磺酸盐、乳糖酸盐、乳酸盐、月桂酸盐、月桂基硫酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、丙二酸盐、甲烷磺酸盐、2-萘磺酸盐、烟酸盐、硝酸盐、油酸盐、草酸盐、棕榈酸盐、双羟萘酸盐、果胶酸盐、过硫酸盐、3-苯基丙酸盐、磷酸盐、特戊酸盐、丙酸盐、硬脂酸盐、琥珀酸盐、硫酸盐、酒石酸盐、硫氰酸盐、对甲苯磺酸盐、十一烷酸盐、戊酸盐等。
衍生自适当碱的盐包括碱金属盐、碱土金属盐、铵盐和N+(C1-4烷基)4盐。代表性碱金属或碱土金属盐包括钠盐、锂盐、钾盐、钙盐、镁盐等。适当时，其它医药学上可接受的盐包括使用例如卤离子、氢氧根、羧酸根、硫酸根、磷酸根、硝酸根、低碳数烷基磺酸根和芳基磺酸根等平衡离子形成的无毒铵、季铵和胺阳离子。
除非另作规定，否则本文描述的结构也拟包括所述结构的所有异构(例如对映异构、非对映异构和几何异构(或构象异构))形式；例如，关于每一不对称中心的R和S构型、Z和E双键异构体以及Z和E构象异构体。因此，本发明化合物的单一立体化学异构体以及对映异构体、非对映异构体和几何异构体(或构象异构体)的混合物都在本发明的范围内。除非另作规定，否则本发明化合物的所有互变异构形式都在本发明的范围内。此外，除非另作规定，否则本文所述的结构也拟包括不同之处仅在于存在一个或一个以上同位素富集的原子的化合物。举例来说，具有本发明的结构但包括氢经氘或氚置换或碳经富集13C或14C的碳置换的化合物在本发明的范围内。此类化合物可用作例如分析工具、生物分析中的探针或本发明的治疗剂。在一些实施例中，式I-a和I-b中的R1基团包含一个或一个以上氘原子。
本文使用的术语“不可逆”或“不可逆抑制剂”是指能够以实质上不可逆的方式共价键结至目标蛋白激酶的抑制剂(即化合物)。也就是说，可逆抑制剂能够结合于(但一般不能形成共价键)目标蛋白激酶，并因此可与所述目标蛋白激酶解离，而不可逆抑制剂在形成共价键后，即保持实质上结合于目标蛋白激酶。不可逆抑制剂通常呈现时间相关性，由此抑制程度随所述抑制剂与酶接触的时间而增加。所属领域的一般技术人员已知用于鉴别一种化合物是否充当不可逆抑制剂的方法。所述方法包括(但不限于)利用蛋白激酶目标对化合物抑制曲线进行酶动力学分析；使用在抑制剂化合物存在下改变的蛋白质药物目标的质谱；不连续暴露，也称为“洗脱”实验；和使用显示酶的共价修饰的标记，例如经放射性标记的抑制剂，以及所属领域的技术人员已知的其它方法。
所属领域的一般技术人员将认识到，某些反应性官能团可充当“弹头”。本文使用的术语“弹头”或“弹头基团”是指本发明化合物上存在的一种官能团，其中所述官能团能够共价结合于目标蛋白质的结合袋中所存在的氨基酸残基(例如半胱氨酸、赖氨酸、组氨酸或其它能够经共价修饰的残基)，由此不可逆抑制所述蛋白质。应了解，本文中所定义和描述的-L-Y基团将提供此类弹头基团以供共价且不可逆地抑制蛋白质。
本文中使用的术语“抑制剂”定义为以可测量的亲和力结合于和/或抑制目标蛋白激酶的化合物。在某些实施例中，抑制剂的IC50值和/或结合常数小于约50μM、小于约1μM、小于约500nM、小于约100nM或小于约10nM。
本文中使用的术语“可测量的亲和力”和“可测量地抑制”是指包含本发明化合物或其组合物以及ErbB1、ErbB2、ErbB3、ErbB4、TEC激酶和/或JAK3中至少一者的样品与包含ErbB1、ErbB2、ErbB3、ErbB4、TEC激酶和/或JAK3中至少一者且无所述化合物或其组合物存在的同等样品之间ErbB1、ErbB2、ErbB3、ErbB4、TEC激酶和/或JAK3中至少一者的活性发生可测量的改变。
3.例示性化合物的描述
根据一方面，本发明提供式I-a或I-b的化合物，
或其医药学上可接受的盐，其中：
环A是任选经取代的选自以下的基团：苯基；3元到7元饱和或部分不饱和碳环；8元到10元双环饱和、部分不饱和或芳基环；具有1到4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的5元到6元单环杂芳基环；具有1到3个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的4元到7元饱和或部分不饱和杂环；具有1到5个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的7元到10元双环饱和或部分不饱和杂环；或具有1到5个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的8元到10元双环杂芳基环；
环B是任选经取代的选自以下的基团：苯基；3元到7元饱和或部分不饱和碳环；8元到10元双环饱和、部分不饱和或芳基环；具有1到4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的5元到6元单环杂芳基环；具有1到3个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的4元到7元饱和或部分不饱和杂环；具有1到5个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的7元到10元双环饱和或部分不饱和杂环；或具有1到5个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的8元到10元双环杂芳基环；
R1是-L-Y，其中：
L是共价键或者二价C1-8饱和或不饱和、直链或分支链烃链，其中L的1、2或3个亚甲基单元任选且独立地经亚环丙基、-NR-、-N(R)C(O)-、-C(O)N(R)-、-N(R)SO2-、-SO2N(R)-、-O-、-C(O)-、-OC(O)-、-C(O)O-、-S-、-SO-、-SO2-、-C(＝S)-、-C(＝NR)-、-N＝N-或-C(＝N2)-置换；
Y是氢；任选经氧代基、卤素或CN取代的C1-6脂肪族基；或具有0到3个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的3元到10元单环或双环饱和、部分不饱和或芳基环，且其中所述环经1到4个独立地选自-Q-Z、氧代基、NO2、卤素、CN或C1-6脂肪族基的基团取代，其中：
Q是共价键或者二价C1-6饱和或不饱和、直链或分支链烃链，其中Q的一个或两个亚甲基单元任选且独立地经-NR-、-S-、-O-、-C(O)-、-SO-或-SO2-置换；且
Z是氢，或任选经氧代基、卤素或CN取代的C1-6脂肪族基；
Ry是氢、卤素、-CN、-CF3、C1-4脂肪族基、C1-4卤代脂肪族基、-OR、-C(O)R或-C(O)N(R)2；
各R基团独立地为氢，或任选经取代的选自以下的基团：C1-6脂肪族基；苯基；具有1到2个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的4元到7元杂环；或具有1到4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的5元到6元单环杂芳基环；
W1和W2各独立地为共价键或二价C1-3亚烷基链，其中W1或W2的一个亚甲基单元任选经-NR2-、-N(R2)C(O)-、-C(O)N(R2)-、-N(R2)SO2-、-SO2N(R2)-、-O-、-C(O)-、-OC(O)-、-C(O)O-、-S-、-SO-或-SO2-置换；
R2是氢、任选经取代的C1-6脂肪族基，或-C(O)R，或：
R2和环A上的取代基与其间的插入原子一起形成4元到6元部分不饱和或芳香族稠合环，或
R2和Ry与其间的插入原子一起形成4元到6元饱和、部分不饱和或芳香族稠合环；
m和p独立地为0到4；且
Rx和Rv独立地选自-R、卤素、-OR、-O(CH2)qOR、-CN、-NO2、-SO2R、-SO2N(R)2、-SOR、-C(O)R、-CO2R、-C(O)N(R)2、-NRC(O)R、-NRC(O)NR2、-NRSO2R或-N(R)2；或：
Rx和R1当同时存在于环B上时，与其间的插入原子一起形成具有0到3个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的5元到7元饱和、部分不饱和或芳基环，其中所述环经弹头基团和0到3个独立地选自氧代基、卤素、-CN或C1-6脂肪族基的基团取代；或
Rv和R1当同时存在于环A上时，与其间的插入原子一起形成具有0到3个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的5元到7元饱和、部分不饱和或芳基环，其中所述环经弹头基团和0到3个独立地选自氧代基、卤素、-CN或C1-6脂肪族基的基团取代。
如上文大体上所定义，环A是任选经取代的选自以下的基团：苯基；3元到7元饱和或部分不饱和碳环；8元到10元双环饱和、部分不饱和或芳基环；具有1到4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的5元到6元单环杂芳基环；具有1到3个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的4元到7元饱和或部分不饱和杂环；具有1到5个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的7元到10元双环饱和或部分不饱和杂环；或具有1到5个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的8元到10元双环杂芳基环。在某些实施例中，环A为任选经取代的苯基。在一些实施例中，环A是任选经取代的萘基环，或者具有1到4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的双环8元到10元杂芳基环。在某些实施例中，环A是任选经取代的3元到7元碳环。在其它实施例中，环A是任选经取代的具有1到3个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的4元到7元杂环。
在某些实施例中，环A如本文所定义经取代。在一些实施例中，环A经1、2或3个独立地选自卤素、R°或-(CH2)0-4OR°或者-O(CH2)0-4R°的基团取代，其中各R°如本文中所定义。环A上的例示性取代基包括Br、I、Cl、甲基、-CF3、-C≡CH、-OCH2苯基、-OCH2(氟苯基)或-OCH2吡啶基。
例示性环A基团陈述于表1中。
表1.例示性环A基团
或
其中各R°、和R1如上文中所定义且如本文的类别和亚类中所描述。
在某些实施例中，环A选自i、ii、iv、v、vi、vii、ix、xiv、xvi、lii、lxiii、lxxi、lxxiv、lxxvi、lxxviii和lxxxi。
如上文大体上所定义，环B是任选经取代的选自以下的基团：苯基；3元到7元饱和或部分不饱和碳环；8元到10元双环饱和、部分不饱和或芳基环；具有1到4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的5元到6元单环杂芳基环；具有1到3个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的4元到7元饱和或部分不饱和杂环；具有1到5个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的7元到10元双环饱和或部分不饱和杂环；或具有1到5个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的8元到10元双环杂芳基环。在某些实施例中，环B为任选经取代的苯基。在一些实施例中，环B是任选经取代的萘基环，或者具有1到4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的双环8元到10元杂芳基环。在某些实施例中，环B是任选经取代的3元到7元碳环。在其它实施例中，环B是具有1到3个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的任选经取代的4元到7元杂环。
在一些实施例中，环B为苯基。在一些实施例中，环B是具有1到3个氮的6元杂芳基环。在一些实施例中，环B是具有1或2或3个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的5元杂芳基环。
在一些实施例中，环B是具有1个氮的5元到6元饱和杂环。在一些实施例中，环B是具有1到3个氮的9元到10元双环部分不饱和杂芳基环。在一些实施例中，环B是具有1个氮的9元到10元双环部分不饱和杂芳基环。在一些实施例中，环B是具有1个氮和1个氧的9元到10元双环部分不饱和杂芳基环。
在一些实施例中，环B是任选经取代的选自以下的基团：苯基、吡啶基、哒嗪基、嘧啶基、咪唑基、吡咯烷基、哌啶基、吲哚啉基、吲唑基和异吲哚啉基。
例示性环B基团陈述于表2中。
表2.环B基团
或
其中各R1和Rx如上文中所定义且如本文的类别和亚类中所描述。
在某些实施例中，环B选自i、ii、iii、iv、v、ix、x、xi、xiii、xvi、xvii、xix、xx、xxv、xxvi、xxxii、xxxiv、xxxv、xxxviii、xlii、xlvi、xlviii、l、lviii、lxiv、lxxviii、lxxxiii、lxxxvi、xciv、c、ci、cii、ciii、civ和cv。
在一些实施例中，式I的m部分是1、2、3或4。在一些实施例中，m为1。在其它实施例中，m为0。
在一些实施例中，式I的p部分是1、2、3或4。在一些实施例中，p为1。在其它实施例中，p为0。
如上文大体上所定义，式I的各Rx基团独立地选自-R、卤素、-OR、-O(CH2)qOR、-CN、-NO2、-SO2R、-SO2N(R)2、-SOR、-C(O)R、-CO2R、-C(O)N(R)2、-NRC(O)R、-NRC(O)NR2、-NRSO2R或-N(R)2，其中q为1到4，或Rx和R1当同时存在于环B上时与其间的插入原子一起形成具有0到3个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的5元到7元饱和、部分不饱和或芳基环，其中所述环经弹头基团和0到3个独立地选自氧代基、卤素、CN或C1-6脂肪族基的基团取代。
在一些实施例中，Rx在各情况下独立地选自-R、-OR、-O(CH2)qOR或卤素。在某些实施例中，Rx是低碳数烷基、低碳数烷氧基、低碳数烷氧基烷氧基或卤素。例示性Rx基团包括甲基、甲氧基、甲氧基乙氧基和氟。在一些实施例中，Rx为氢。
如上文大体上所定义，式I的各Rv基团独立地选自-R、卤素、-OR、-O(CH2)qOR、-CN、-NO2、-SO2R、-SO2N(R)2、-SOR、-C(O)R、-CO2R、-C(O)N(R)2、-NRC(O)R、-NRC(O)NR2、-NRSO2R或-N(R)2，其中q为1到4，或Rv和R1当同时存在于环A上时与其间的插入原子一起形成具有0到3个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的5元到7元饱和、部分不饱和或芳基环，其中所述环经弹头基团和0到3个独立地选自氧代基、卤素、CN或C1-6脂肪族基的基团取代。
在一些实施例中，Rv在各情况下独立地选自-R、-OR、-O(CH2)qOR或卤素。在某些实施例中，Rv是低碳数烷基、低碳数烷氧基、低碳数烷氧基烷氧基或卤素。例示性Rv基团包括甲基、甲氧基、三氟甲基、甲氧基乙氧基和氯。在一些实施例中，Rv为氢。
在一些实施例中，q部分为1、2、3或4。在某些实施例中，q为1。在某些其它实施例中，q为2。
如上文大体上所定义，Ry是氢、卤素、-CN、-CF3、C1-4脂肪族基、C1-4卤代脂肪族基、-OR、-C(O)R或-C(O)N(R)2，其中R如上文中所定义且如本文所描述。在某些实施例中，Ry是氢、卤素、-CN、-CF3、低碳数烷基或低碳数卤烷基、-C≡CR和环丙基。在其它实施例中，Ry是-OR、-C(O)R或-C(O)N(R)2。在某些实施例中，Ry是-OCH3。在某些其它实施例中，Ry为-C(O)CH3。在其它实施例中，Ry为-C(O)NHR。在一些实施例中，Ry为氢。在某些实施例中，Ry是氟。在某些其它实施例中，Ry为甲基。
如上文大体上所定义，W1和W2各独立地为共价键或二价C1-3亚烷基链，其中W1或W2的一个亚甲基单元任选经-NR2-、-N(R2)C(O)-、-C(O)N(R2)-、-N(R2)SO2-、-SO2N(R2)-、-O-、-C(O)-、-OC(O)-、-C(O)O-、-S-、-SO-或-SO2-置换。在某些实施例中，W1与W2相同。在一些实施例中，W1与W2不同。
在一些实施例中，W1是共价键。在某些实施例中，W1为二价C1-3亚烷基链，其中W1的一个亚甲基单元任选经-NR2-、-N(R2)C(O)-、-C(O)N(R2)-、-N(R2)SO2-、-SO2N(R2)-、-O-、-C(O)-、-OC(O)-、-C(O)O-、-S-、-SO-或-SO2-置换。在某些实施例中，W1为-C(＝O)、-NR2-、-S-或-O-。在一些实施例中，W1为-NR2-。在其它实施例中，W1为-O-。在某些实施例中，W1为-NH-、-S-或-O-。在一些实施例中，W1为-CH2O-、-CH2S-或-CH2NH-。在一些方面中，W1为-OCH2-、-SCH2-、-NHCH2-或-CH2CH2-。
在某些实施例中，W2为共价键。在一些实施例中，W2为二价C1-3亚烷基链，其中W2的一个亚甲基单元任选经-NR2-、-N(R2)C(O)-、-C(O)N(R2)-、-N(R2)SO2-、-SO2N(R2)-、-O-、-C(O)-、-OC(O)-、-C(O)O-、-S-、-SO-或-SO2-置换。在某些实施例中，W2为-C(＝O)、-NR2-、-S-或-O-。在一些实施例中，W2是-NR2-。在其它实施例中，W2为-O-。在某些实施例中，W2为-NH-、-S-或-O-。在一些实施例中，W2为-CH2O-、-CH2S-或-CH2NH-。在一些方面中，W2为-CH2O-、-SCH2-、-NHCH2-或-CH2CH2-。
在一些实施例中，环B是苯基，由此形成式II-a或II-b的化合物：
或其医药学上可接受的盐，其中环A、m、p、Rx、Ry、Rv、W1、W2和R1各自如上文所定义且如上文和本文中的类别和亚类中所描述。
在某些实施例中，环A是苯基，由此形成式III-a或III-b的化合物：
或其医药学上可接受的盐，其中环B、m、p、Rx、Ry、Rv、W1、W2和R1各自如上文所定义且如上文和本文中的类别和亚类中所描述。
在某些实施例中，环A是苯基且环B是苯基，由此形成式IV-a或IV-b的化合物：
或其医药学上可接受的盐，其中m、p、Rx、Ry、Rv、W1、W2和R1各自如上文所定义且如上文和本文中的类别和亚类中所描述。
如上文大体上所定义，各R2独立地为氢、任选经取代的C1-6脂肪族基，或-C(O)R，或者R2和环A上的取代基与其间的插入原子一起形成4元到6元部分不饱和或芳香族稠合环，或者R2和Ry与其间的插入原子一起形成4元到6元饱和、部分不饱和或芳香族稠合环。根据一方面，R2为氢。根据另一方面，R2为-C(O)R，其中R为任选经取代的C1-6脂肪族基。
根据一些方面，R2和环A上的取代基与其间的插入原子一起形成4元到7元饱和或部分不饱和环，由此形成式I-a-i或I-b-i的化合物：
或其医药学上可接受的盐，其中环A、R1、Rx和m各自如上文所定义且如上文和本文中的类别和亚类中所描述。
与上文式I-a-i和I-b-i的化合物的形成类似，所属领域的技术人员应了解，当R2和环A上的取代基与其间的插入原子一起形成4元到7元饱和或部分不饱和环时，式II-a、II-b、III-a、III-b、IV-a和IV-b的化合物将形成相应的化合物II-a-i、II-b-i、III-a-i、III-b-i、IV-a-i和IV-b-i。
根据一些方面，R2和Ry与其间的插入原子一起形成4元到7元部分不饱和环，由此形成式I-a-ii或I-b-ii的化合物：
或其医药学上可接受的盐，其中环A、R1、Rx和m各自如上文所定义且如上文和本文中的类别和亚类中所描述。
与上文式I-a-ii和I-b-ii的化合物的形成类似，所属领域的技术人员应了解，当R2和Ry与其间的插入原子一起形成4元到7元部分不饱和环时，式II-a、II-b、III-a、III-b、IV-a和IV-b的化合物将形成相应的化合物II-a-ii、II-b-ii、III-a-ii、III-b-ii、IV-a-ii和IV-b-ii。
如上文大体上所定义，式I和II的R1基团是-L-Y，其中：
L是共价键或者二价C1-8饱和或不饱和、直链或分支链烃链，其中L的1、2或3个亚甲基单元任选且独立地经亚环丙基、-NR-、-N(R)C(O)-、-C(O)N(R)-、-N(R)SO2-、-SO2N(R)-、-O-、-C(O)-、-OC(O)-、-C(O)O-、-S-、-SO-、-SO2-、-C(＝S)-、-C(＝NR)-、-N＝N-或-C(＝N2)-置换；
Y是氢；任选经氧代基、卤素、NO2或CN取代的C1-6脂肪族基；或具有0到3个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的3元到10元单环或双环饱和、部分不饱和或芳基环，且其中所述环经1到4个Re基团取代；且
各Re独立地选自-Q-Z、氧代基、NO2、卤素、CN、适合的离去基团，或任选经氧代基、卤素、NO2或CN取代的C1-6脂肪族基，其中：
Q是共价键或者二价C1-6饱和或不饱和、直链或分支链烃链，其中Q的一个或两个亚甲基单元任选且独立地经-N(R)-、-S-、-O-、-C(O)-、-OC(O)-、-C(O)O-、-SO-或-SO2-、-N(R)C(O)-、-C(O)N(R)-、-N(R)SO2-或-SO2N(R)-置换；且
Z是氢，或任选经氧代基、卤素、NO2或CN取代的C1-6脂肪族基。
在某些实施例中，L为共价键。
在某些实施例中，L为二价C1-8饱和或不饱和、直链或分支链烃链。在某些实施例中，L为-CH2-。
在某些实施例中，L为共价键、-CH2-、-NH-、-CH2NH-、-NHCH2-、-NHC(O)-、-NHC(O)CH2OC(O)-、-CH2NHC(O)-、-NHSO2-、-NHSO2CH2-、-NHC(O)CH2OC(O)-或-SO2NH-。
在一些实施例中，L为二价C2-8直链或分支链烃链，其中L具有至少一个双键，且L的一个或两个其它亚甲基单元任选且独立地经-NRC(O)-、-C(O)NR-、-N(R)SO2-、-SO2N(R)-、-S-、-S(O)-、-SO2-、-OC(O)-、-C(O)O-、亚环丙基、-O-、-N(R)-或-C(O)-置换。
在某些实施例中，L为二价C2-8直链或分支链烃链，其中L具有至少一个双键，且L的至少一个亚甲基单元经-C(O)-、-NRC(O)-、-C(O)NR-、-N(R)SO2-、-SO2N(R)-、-S-、-S(O)-、-SO2-、-OC(O)-或-C(O)O-置换，并且L的一个或两个其它亚甲基单元任选且独立地经亚环丙基、-O-、-N(R)-或-C(O)-置换。
在一些实施例中，L为二价C2-8直链或分支链烃链，其中L具有至少一个双键，且L的至少一个亚甲基单元经-C(O)-置换，并且L的一个或两个其它亚甲基单元任选且独立地经亚环丙基、-O-、-N(R)-或-C(O)-置换。
如上文所述，在某些实施例中，L为二价C2-8直链或分支链烃链，其中L具有至少一个双键。所属领域的一般技术人员将认识到，所述双键可存在于烃链主链内，或者可在主链“外”，并由此形成次烷基。举例来说，具有次烷基分支链的所述L基团包括-CH2C(＝CH2)CH2-。因此，在一些实施例中，L为二价C2-8直链或分支链烃链，其中L具有至少一个次烷基双键。例示性L基团包括-NHC(O)C(＝CH2)CH2-。
在某些实施例中，L为二价C2-8直链或分支链烃链，其中L具有至少一个双键，且L的至少一个亚甲基单元经-C(O)-置换。在某些实施例中，L为-C(O)CH＝CH(CH3)-、-C(O)CH＝CHCH2NH(CH3)-、-C(O)CH＝CH(CH3)-、-C(O)CH＝CH-、-CH2C(O)CH＝CH-、-CH2C(O)CH＝CH(CH3)-、-CH2CH2C(O)CH＝CH-、-CH2CH2C(O)CH＝CHCH2-、-CH2CH2C(O)CH＝CHCH2NH(CH3)-或-CH2CH2C(O)CH＝CH(CH3)-或者-CH(CH3)OC(O)CH＝CH-。
在某些实施例中，L为二价C2-8直链或分支链烃链，其中L具有至少一个双键，且L的至少一个亚甲基单元经-OC(O)-置换。
在一些实施例中，L为二价C2-8直链或分支链烃链，其中L具有至少一个双键，且L的至少一个亚甲基单元经-NRC(O)-、-C(O)NR-、-N(R)SO2-、-SO2N(R)-、-S-、-S(O)-、-SO2-、-OC(O)-或-C(O)O-置换，并且L的一个或两个其它亚甲基单元任选且独立地经亚环丙基、-O-、-N(R)-或-C(O)-置换。在一些实施例中，L为-CH2OC(O)CH＝CHCH2-、-CH2-OC(O)CH＝CH-或-CH(CH＝CH2)OC(O)CH＝CH-。
在某些实施例中，L为-NRC(O)CH＝CH-、-NRC(O)CH＝CHCH2N(CH3)-、-NRC(O)CH＝CHCH2O-、-CH2NRC(O)CH＝CH-、-NRSO2CH＝CH-、-NRSO2CH＝CHCH2-、-NRC(O)(C＝N2)C(O)-、-NRC(O)CH＝CHCH2N(CH3)-、-NRSO2CH＝CH-、-NRSO2CH＝CHCH2-、-NRC(O)CH＝CHCH2O-、-NRC(O)C(＝CH2)CH2-、-CH2NRC(O)-、-CH2NRC(O)CH＝CH-、-CH2CH2NRC(O)-或-CH2NRC(O)亚环丙基，其中各R独立地为氢或任选经取代的C1-6脂肪族基。
在某些实施例中，L为-NHC(O)CH＝CH-、-NHC(O)CH＝CHCH2N(CH3)-、-NHC(O)CH＝CHCH2O-、-CH2NHC(O)CH＝CH-、-NHSO2CH＝CH-、-NHSO2CH＝CHCH2-、-NHC(O)(C＝N2)C(O)-、-NHC(O)CH＝CHCH2N(CH3)-、-NHSO2CH＝CH-、-NHSO2CH＝CHCH2-、-NHC(O)CH＝CHCH2O-、-NHC(O)C(＝CH2)CH2-、-CH2NHC(O)-、-CH2NHC(O)CH＝CH-、-CH2CH2NHC(O)-或-CH2NHC(O)亚环丙基-。
在一些实施例中，L为二价C2-8直链或分支链烃链，其中L具有至少一个三键。在某些实施例中，L为二价C2-8直链或分支链烃链，其中L具有至少一个三键，且L的一个或两个其它亚甲基单元任选且独立地经-NRC(O)-、-C(O)NR-、-S-、-S(O)-、-SO2-、-C(＝S)-、-C(＝NR)-、-O-、-N(R)-或-C(O)-置换。在一些实施例中，L具有至少一个三键，且L的至少一个亚甲基单元经-N(R)-、-N(R)C(O)-、-C(O)-、-C(O)O-或-OC(O)-或-O-置换。
例示性L基团包括-C≡C-、-C≡CCH2N(异丙基)-、-NHC(O)C≡CCH2CH2-、-CH2-C≡C-CH2-、-C≡CCH2O-、-CH2C(O)C≡C-、-C(O)C＝C-或-CH2OC(＝O)C≡C-。
在某些实施例中，L为二价C2-8直链或分支链烃链，其中L的一个亚甲基单元经亚环丙基置换，且L的一个或两个其它亚甲基单元独立地经-C(O)-、-NRC(O)-、-C(O)NR-、-N(R)SO2-或-SO2N(R)-置换。例示性L基团包括-NHC(O)-亚环丙基-SO2-和-NHC(O)-亚环丙基-。
如上文大体上所定义，Y为氢；任选经氧代基、卤素、NO2或CN取代的C1-6脂肪族基；或具有0到3个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的3元到10元单环或双环饱和、部分不饱和或芳基环，且其中所述环经1到4个Re基团取代，各Re独立地选自-Q-Z、氧代基、NO2、卤素、CN、适合的离去基团或C1-6脂肪族基，其中Q为共价键或二价C1-6饱和或不饱和直链或分支链烃链，其中Q的一个或两个亚甲基单元任选且独立地经-N(R)-、-S-、-O-、-C(O)-、-OC(O)-、-C(O)O-、-SO-或-SO2-、-N(R)C(O)-、-C(O)N(R)-、-N(R)SO2-或-SO2N(R)-置换；且Z为氢，或任选经氧代基、卤素、NO2或CN取代的C1-6脂肪族基。
在某些实施例中，Y为氢。
在某些实施例中，Y为任选经氧代基、卤素、NO2或CN取代的C1-6脂肪族基。在一些实施例中，Y为任选经氧代基、卤素、NO2或CN取代的C2-6烯基。在其它实施例中，Y为任选经氧代基、卤素、NO2或CN取代的C2-6炔基。在一些实施例中，Y为C2-6烯基。在其它实施例中，Y为C2-4炔基。
在其它实施例中，Y为经氧代基、卤素、NO2或CN取代的C1-6烷基。所述Y基团包括-CH2F、-CH2Cl、-CH2CN和-CH2NO2。
在某些实施例中，Y为具有0到3个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的饱和3元到6元单环，其中Y经1到4个Re基团取代，其中各Re如上文所定义且如本文所描述。
在一些实施例中，Y为具有1个选自氧或氮的杂原子的饱和3元到4元杂环，其中所述环经1到2个Re基团取代，其中各Re如上文所定义且如本文所描述。例示性所述环是环氧化物和氧杂环丁烷环，其中各环经1到2个Re基团取代，其中各Re如上文所定义且如本文所描述。
在其它实施例中，Y为具有1到2个选自氧或氮的杂原子的饱和5元到6元杂环，其中所述环经1到4个Re基团取代，其中各Re如上文所定义且如本文所描述。所述环包括哌啶和吡咯烷，其中各环经1到4个Re基团取代，其中各Re如上文所定义且如本文所描述。在某些实施例中，Y为 或其中各R、Q、Z和Re如上文所定义且如本文所描述。
在一些实施例中，Y为饱和3元到6元碳环，其中所述环经1到4个Re基团取代，其中各Re如上文所定义且如本文所描述。在某些实施例中，Y为环丙基、环丁基、环戊基或环己基，其中各环经1到4个Re基团取代，其中各Re如上文所定义且如本文所描述。在某些实施例中，Y为其中Re如上文所定义且如本文所描述。在某些实施例中，Y为任选经卤素、CN或NO2取代的环丙基。
在某些实施例中，Y为具有0到3个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的部分不饱和3元到6元单环，其中所述环经1到4个Re基团取代，其中各Re如上文所定义且如本文所描述。
在一些实施例中，Y为部分不饱和3元到6元碳环，其中所述环经1到4个Re基团取代，其中各Re如上文所定义且如本文所描述。在一些实施例中，Y为环丙烯基、环丁烯基、环戊烯基或环己烯基，其中各环经1到4个Re基团取代，其中各Re如上文所定义且如本文所描述。在某些实施例中，Y为其中各Re如上文所定义且如本文所描述。
在某些实施例中，Y为具有1到2个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的部分不饱和4元到6元杂环，其中所述环经1到4个Re基团取代，其中各Re如上文所定义且如本文所描述。在某些实施例中，Y选自：
其中各R和Re如上文所定义且如本文所描述。
在某些实施例中，Y为具有0到2个氮的6元芳香族环，其中所述环经1到4个Re基团取代，其中各Re如上文所定义且如本文所描述。在某些实施例中，Y为苯基、吡啶基或嘧啶基，其中各环经1到4个Re基团取代，其中各Re如上文所定义且如本文所描述。
在一些实施例中，Y选自：
其中各Re如上文所定义且如本文所描述。
在其它实施例中，Y为具有1到3个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的5元杂芳基环，其中所述环经1到3个Re基团取代，其中各Re如上文所定义且如本文所描述。在一些实施例中，Y为具有1到3个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的5元部分不饱和或芳基环，其中所述环经1到4个Re基团取代，其中各Re如上文所定义且如本文所描述。例示性所述环为异噁唑基、噁唑基、噻唑基、咪唑基、吡唑基、吡咯基、呋喃基、噻吩基、三唑、噻二唑和噁二唑，其中各环经1到3个Re基团取代，其中各Re如上文所定义且如本文所描述。在某些实施例中，Y选自：
其中各R和Re如上文所定义且如本文所描述。
在某些实施例中，Y为具有0到3个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的8元到10元双环饱和、部分不饱和或芳基环，其中所述环经1到4个Re基团取代，其中Re如上文所定义且如本文所描述。根据另一方面，Y为具有1到3个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的9元到10元双环部分不饱和或芳基环，其中所述环经1到4个Re基团取代，其中Re如上文所定义且如本文所描述。例示性所述双环包括2,3-二氢苯并[d]异噻唑，其中所述环经1到4个Re基团取代，其中Re如上文所定义且如本文所描述。
如上文大体上所定义，各Re基团独立地选自-Q-Z、氧代基、NO2、卤素、CN、适合的离去基团，或任选经氧代基、卤素、NO2或CN取代的C1-6脂肪族基，其中Q为共价键或者二价C1-6饱和或不饱和直链或分支链烃链，其中Q的一个或两个亚甲基单元任选且独立地经-N(R)-、-S-、-O-、-C(O)-、-OC(O)-、-C(O)O-、-SO-或-SO2-、-N(R)C(O)-、-C(O)N(R)-、-N(R)SO2-或-SO2N(R)-置换；且Z为氢，或任选经氧代基、卤素、NO2或CN取代的C1-6脂肪族基。
在某些实施例中，Re为任选经氧代基、卤素、NO2或CN取代的C1-6脂肪族基。在其它实施例中，Re为氧代基、NO2、卤素或CN。
在一些实施例中，Re为-Q-Z，其中Q为共价键，且Z为氢(即，Re为氢)。在其它实施例中，Re为-Q-Z，其中Q为二价C1-6饱和或不饱和直链或分支链烃链，其中Q的一个或两个亚甲基单元任选且独立地经-NR-、-NRC(O)-、-C(O)NR-、-S-、-O-、-C(O)-、-SO-或-SO2-置换。在其它实施例中，Q为具有至少一个双键的二价C2-6直链或分支链烃链，其中Q的一个或两个亚甲基单元任选且独立地经-NR-、-NRC(O)-、-C(O)NR-、-S-、-O-、-C(O)-、-SO-或-SO2-置换。在某些实施例中，Re基团的Z部分为氢。在一些实施例中，-Q-Z为-NHC(O)CH＝CH2或-C(O)CH＝CH2。
在某些实施例中，各Re独立地选自氧代基、NO2、CN、氟、氯、-NHC(O)CH＝CH2、-C(O)CH＝CH2、-CH2CH＝CH2、-C≡CH、-C(O)OCH2Cl、-C(O)OCH2F、-C(O)OCH2CN、-C(O)CH2Cl、-C(O)CH2F、-C(O)CH2CN或-CH2C(O)CH3。
在某些实施例中，Re为适合的离去基团，即经受亲核置换的基团。“适合的离去基团”是易于被需要引入的化学部分置换的化学基团，例如相关半胱氨酸的硫醇部分。适合的离去基团在所属领域中众所周知，例如参看"高等有机化学(Advanced OrganicChemistry),"杰瑞马奇(Jerry March),第5版,第351-第357页,约翰威立父子出版公司(John Wiley and Sons),纽约(N.Y)。所述离去基团包括(但不限于)卤素、烷氧基、磺酰氧基、任选经取代的烷基磺酰氧基、任选经取代的烯基磺酰氧基、任选经取代的芳基磺酰氧基、酰基和重氮部分。适合的离去基团的实例包括氯、碘、溴、氟、乙酰氧基、甲烷磺酰氧基(甲磺酰氧基)、甲苯磺酰氧基、三氟甲磺酰氧基、硝基-苯基磺酰氧基(硝基苯磺酰氧基)和溴-苯基磺酰氧基(溴苯磺酰氧基)。
在某些实施例中，-L-Y的以下实施例和组合应适用：
(a)L为二价C2-8直链或分支链烃链，其中L具有至少一个双键，且L的一个或两个其它亚甲基单元任选且独立地经-NRC(O)-、-C(O)NR-、-N(R)SO2-、-SO2N(R)-、-S-、-S(O)-、-SO2-、-OC(O)-、-C(O)O-、亚环丙基、-O-、-N(R)-或-C(O)-置换；且Y为氢，或任选经氧代基、卤素、NO2或CN取代的C1-6脂肪族基；或
(b)L为二价C2-8直链或分支链烃链，其中L具有至少一个双键，且L的至少一个亚甲基单元经-C(O)-、-NRC(O)-、-C(O)NR-、-N(R)SO2-、-SO2N(R)-、-S-、-S(O)-、-SO2-、-OC(O)-或-C(O)O-置换，并且L的一个或两个其它亚甲基单元任选且独立地经亚环丙基、-O-、-N(R)-或-C(O)-置换；且Y为氢，或任选经氧代基、卤素、NO2或CN取代的C1-6脂肪族基；或
(c)L为二价C2-8直链或分支链烃链，其中L具有至少一个双键，且L的至少一个亚甲基单元经-C(O)-置换，并且L的一个或两个其它亚甲基单元任选且独立地经亚环丙基、-O-、-N(R)-或-C(O)-置换；且Y为氢，或任选经氧代基、卤素、NO2或CN取代的C1-6脂肪族基；或
(d)L为二价C2-8直链或分支链烃链，其中L具有至少一个双键，且L的至少一个亚甲基单元经-C(O)-置换；且Y为氢，或任选经氧代基、卤素、NO2或CN取代的C1-6脂肪族基；或
(e)L为二价C2-8直链或分支链烃链，其中L具有至少一个双键，且L的至少一个亚甲基单元经-OC(O)-置换；且Y为氢，或任选经氧代基、卤素、NO2或CN取代的C1-6脂肪族基；或
(f)L为-NRC(O)CH＝CH-、-NRC(O)CH＝CHCH2N(CH3)-、-NRC(O)CH＝CHCH2O-、-CH2NRC(O)CH＝CH-、-NRSO2CH＝CH-、-NRSO2CH＝CHCH2-、-NRC(O)(C＝N2)-、-NRC(O)(C＝N2)C(O)-、-NRC(O)CH＝CHCH2N(CH3)-、-NRSO2CH＝CH-、-NRSO2CH＝CHCH2-、-NRC(O)CH＝CHCH2O-、-NRC(O)C(＝CH2)CH2-、-CH2NRC(O)-、-CH2NRC(O)CH＝CH-、-CH2CH2NRC(O)-或-CH2NRC(O)亚环丙基-，其中R为氢或任选经取代的C1-6脂肪族基；且Y为氢，或任选经氧代基、卤素、NO2或CN取代的C1-6脂肪族基；或
(g)L为-NHC(O)CH＝CH-、-NHC(O)CH＝CHCH2N(CH3)-、-NHC(O)CH＝CHCH2O-、-CH2NHC(O)CH＝CH-、-NHSO2CH＝CH-、-NHSO2CH＝CHCH2-、-NHC(O)(C＝N2)-、-NHC(O)(C＝N2)C(O)-、-NHC(O)CH＝CHCH2N(CH3)-、-NHSO2CH＝CH-、-NHSO2CH＝CHCH2-、-NHC(O)CH＝CHCH2O-、-NHC(O)C(＝CH2)CH2-、-CH2NHC(O)-、-CH2NHC(O)CH＝CH-、-CH2CH2NHC(O)-或-CH2NHC(O)亚环丙基-；且Y为氢，或任选经氧代基、卤素、NO2或CN取代的C1-6脂肪族基；或
(h)L为二价C2-8直链或分支链烃链，其中L具有至少一个次烷基双键，且L的至少一个亚甲基单元经-C(O)-、-NRC(O)-、-C(O)NR-、-N(R)SO2-、-SO2N(R)-、-S-、-S(O)-、-SO2-、-OC(O)-或-C(O)O-置换，并且L的一个或两个其它亚甲基单元任选且独立地经亚环丙基、-O-、-N(R)-或-C(O)-置换；且Y为氢，或任选经氧代基、卤素、NO2或CN取代的C1-6脂肪族基；或
(i)L为二价C2-8直链或分支链烃链，其中L具有至少一个三键，且L的一个或两个其它亚甲基单元任选且独立地经-NRC(O)-、-C(O)NR-、-N(R)SO2-、-SO2N(R)-、-S-、-S(O)-、-SO2-、-OC(O)-或-C(O)O-置换；且Y为氢，或任选经氧代基、卤素、NO2或CN取代的C1-6脂肪族基；或
(j)L为-C≡C-、-C≡CCH2N(异丙基)-、-NHC(O)C≡CCH2CH2-、-CH2-C≡C-CH2-、-C≡CCH2O-、-CH2C(O)C≡C-、-C(O)C≡C-或-CH2OC(＝O)C≡C-；且Y为氢，或任选经氧代基、卤素、NO2或CN取代的C1-6脂肪族基；或
(k)L为二价C2-8直链或分支链烃链，其中L的一个亚甲基单元经亚环丙基置换，且L的一个或两个其它亚甲基单元独立地经-NRC(O)-、-C(O)NR-、-N(R)SO2-、-SO2N(R)-、-S-、-S(O)-、-SO2-、-OC(O)-或-C(O)O-置换；且Y为氢，或任选经氧代基、卤素、NO2或CN取代的C1-6脂肪族基；或
(l)L为共价键且Y选自：
(i)经氧代基、卤素、NO2或CN取代的C1-6烷基；
(ii)任选经氧代基、卤素、NO2或CN取代的C2-6烯基；
(iii)任选经氧代基、卤素、NO2或CN取代的C2-6炔基；或
(iv)具有1个选自氧或氮的杂原子的饱和3元到4元杂环，其中所述环经1到2个Re基团取代，其中各Re如上文所定义且如本文所描述；或
(v)具有1到2个选自氧或氮的杂原子的饱和5元到6元杂环，其中所述环经1到4个Re基团取代，其中各Re如上文所定义且如本文所描述；或
(vi) 或其中各R、Q、Z和Re如上文所定义且如本文所描述；或
(vii)饱和3元到6元碳环，其中所述环经1到4个Re基团取代，其中各Re如上文所定义且如本文所描述；或
(viii)具有0到3个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的部分不饱和3元到6元单环，其中所述环经1到4个Re基团取代，其中各Re如上文所定义且如本文所描述；或
(ix)部分不饱和3元到6元碳环，其中所述环经1到4个Re基团取代，其中各Re如上文所定义且如本文所描述；或
(x)其中各Re如上文所定义且如本文所描述；或
(xi)具有1到2个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的部分不饱和4元到6元杂环，其中所述环经1到4个Re基团取代，其中各Re如上文所定义且如本文所描述；或
(xii)或
其中各R和Re如上文所定义且如本文所描述；或
(xiii)具有0到2个氮的6元芳香族环，其中所述环经1到4个Re基团取代，其中各Re如上文所定义且如本文所描述；或
(xiv)
其中各Re如上文所定义且如本文所描述；或
(xv)具有1到3个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的5元杂芳基环，其中所述环经1到3个Re基团取代，其中各Re如上文所定义且如本文所描述；或
(xvi)
其中各R和Re如上文所定义且如本文所描述；或
(xvii)具有0到3个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的8元到10元双环饱和、部分不饱和或芳基环，其中所述环经1到4个Re基团取代，其中Re如上文所定义且如本文所描述；
(m)L为-C(O)-，且Y选自：
(i)经氧代基、卤素、NO2或CN取代的C1-6烷基；或
(ii)任选经氧代基、卤素、NO2或CN取代的C2-6烯基；或
(iii)任选经氧代基、卤素、NO2或CN取代的C2-6炔基；或
(iv)具有1个选自氧或氮的杂原子的饱和3元到4元杂环，其中所述环经1到2个Re基团取代，其中各Re如上文所定义且如本文所描述；或
(v)具有1到2个选自氧或氮的杂原子的饱和5元到6元杂环，其中所述环经1到4个Re基团取代，其中各Re如上文所定义且如本文所描述；或
(vi) 或其中各R、Q、Z和Re如上文所定义且如本文所描述；或
(vii)饱和3元到6元碳环，其中所述环经1到4个Re基团取代，其中各Re如上文所定义且如本文所描述；或
(viii)具有0到3个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的部分不饱和3元到6元单环，其中所述环经1到4个Re基团取代，其中各Re如上文所定义且如本文所描述；或
(ix)部分不饱和3元到6元碳环，其中所述环经1到4个Re基团取代，其中各Re如上文所定义且如本文所描述；或
(x)其中各Re如上文所定义且如本文所描述；或
(xi)具有1到2个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的部分不饱和4元到6元杂环，其中所述环经1到4个Re基团取代，其中各Re如上文所定义且如本文所描述；或
(xii)或
其中各R和Re如上文所定义且如本文所描述；或
(xiii)具有0到2个氮的6元芳香族环，其中所述环经1到4个Re基团取代，其中各Re如上文所定义且如本文所描述；或
(xiv)
其中各Re如上文所定义且如本文所描述；或
(xv)具有1到3个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的5元杂芳基环，其中所述环经1到3个Re基团取代，其中各Re如上文所定义且如本文所描述；或
(xvi)
其中各R和Re如上文所定义且如本文所描述；或
(xvii)具有0到3个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的8元到10元双环饱和、部分不饱和或芳基环，其中所述环经1到4个Re基团取代，其中Re如上文所定义且如本文所描述；
(n)L为-N(R)C(O)-，且Y选自：
(i)经氧代基、卤素、NO2或CN取代的C1-6烷基；或
(ii)任选经氧代基、卤素、NO2或CN取代的C2-6烯基；或
(iii)任选经氧代基、卤素、NO2或CN取代的C2-6炔基；或
(iv)具有1个选自氧或氮的杂原子的饱和3元到4元杂环，其中所述环经1到2个Re基团取代，其中各Re如上文所定义且如本文所描述；或
(v)具有1到2个选自氧或氮的杂原子的饱和5元到6元杂环，其中所述环经1到4个Re基团取代，其中各Re如上文所定义且如本文所描述；或
(vi) 或其中各R、Q、Z和Re如上文所定义且如本文所描述；或
(vii)饱和3元到6元碳环，其中所述环经1到4个Re基团取代，其中各Re如上文所定义且如本文所描述；或
(viii)具有0到3个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的部分不饱和3元到6元单环，其中所述环经1到4个Re基团取代，其中各Re如上文所定义且如本文所描述；或
(ix)部分不饱和3元到6元碳环，其中所述环经1到4个Re基团取代，其中各Re如上文所定义且如本文所描述；或
(x)其中各Re如上文所定义且如本文所描述；或
(xi)具有1到2个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的部分不饱和4元到6元杂环，其中所述环经1到4个Re基团取代，其中各Re如上文所定义且如本文所描述；或
(xii)或
其中各R和Re如上文所定义且如本文所描述；或
(xiii)具有0到2个氮的6元芳香族环，其中所述环经1到4个Re基团取代，其中各Re如上文所定义且如本文所描述；或
(xiv)
其中各Re如上文所定义且如本文所描述；或
(xv)具有1到3个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的5元杂芳基环，其中所述环经1到3个Re基团取代，其中各Re如上文所定义且如本文所描述；或
(xvi)
其中各R和Re如上文所定义且如本文所描述；或
(xvii)具有0到3个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的8元到10元双环饱和、部分不饱和或芳基环，其中所述环经1到4个Re基团取代，其中Re如上文所定义且如本文所描述；
(O)L为二价C1-8饱和或不饱和直链或分支链烃链；且Y选自：
(i)经氧代基、卤素、NO2或CN取代的C1-6烷基；
(ii)任选经氧代基、卤素、NO2或CN取代的C2-6烯基；或
(iii)任选经氧代基、卤素、NO2或CN取代的C2-6炔基；或
(iv)具有1个选自氧或氮的杂原子的饱和3元到4元杂环，其中所述环经1到2个Re基团取代，其中各Re如上文所定义且如本文所描述；或
(v)具有1到2个选自氧或氮的杂原子的饱和5元到6元杂环，其中所述环经1到4个Re基团取代，其中各Re如上文所定义且如本文所描述；或
(vi) 或其中各R、Q、Z和Re如上文所定义且如本文所描述；或
(vii)饱和3元到6元碳环，其中所述环经1到4个Re基团取代，其中各Re如上文所定义且如本文所描述；或
(viii)具有0到3个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的部分不饱和3元到6元单环，其中所述环经1到4个Re基团取代，其中各Re如上文所定义且如本文所描述；或
(ix)部分不饱和3元到6元碳环，其中所述环经1到4个Re基团取代，其中各Re如上文所定义且如本文所描述；或
(x)其中各Re如上文所定义且如本文所描述；或
(xi)具有1到2个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的部分不饱和4元到6元杂环，其中所述环经1到4个Re基团取代，其中各Re如上文所定义且如本文所描述；或
(xii)或
其中各R和Re如上文所定义且如本文所描述；或
(xiii)具有0到2个氮的6元芳香族环，其中所述环经1到4个Re基团取代，其中各Re如上文所定义且如本文所描述；或
(xiv)
其中各Re如上文所定义且如本文所描述；或
(xv)具有1到3个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的5元杂芳基环，其中所述环经1到3个Re基团取代，其中各Re如上文所定义且如本文所描述；或
(xvi)
其中各R和Re如上文所定义且如本文所描述；或
(xvii)具有0到3个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的8元到10元双环饱和、部分不饱和或芳基环，其中所述环经1到4个Re基团取代，其中Re如上文所定义且如本文所描述；
(p)L为共价键、-CH2-、-NH-、-C(O)-、-CH2NH-、-NHCH2-、-NHC(O)-、-NHC(O)CH2OC(O)-、-CH2NHC(O)-、-NHSO2-、-NHSO2CH2-、-NHC(O)CH2OC(O)-或-SO2NH-；且Y选自：
(i)经氧代基、卤素、NO2或CN取代的C1-6烷基；或
(ii)任选经氧代基、卤素、NO2或CN取代的C2-6烯基；或
(iii)任选经氧代基、卤素、NO2或CN取代的C2-6炔基；或
(iv)具有1个选自氧或氮的杂原子的饱和3元到4元杂环，其中所述环经1到2个Re基团取代，其中各Re如上文所定义且如本文所描述；或
(v)具有1到2个选自氧或氮的杂原子的饱和5元到6元杂环，其中所述环经1到4个Re基团取代，其中各Re如上文所定义且如本文所描述；或
(vi) 或其中各R、Q、Z和Re如上文所定义且如本文所描述；或
(vii)饱和3元到6元碳环，其中所述环经1到4个Re基团取代，其中各Re如上文所定义且如本文所描述；或
(viii)具有0到3个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的部分不饱和3元到6元单环，其中所述环经1到4个Re基团取代，其中各Re如上文所定义且如本文所描述；或
(ix)部分不饱和3元到6元碳环，其中所述环经1到4个Re基团取代，其中各Re如上文所定义且如本文所描述；或
(x)其中各Re如上文所定义且如本文所描述；或
(xi)具有1到2个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的部分不饱和4元到6元杂环，其中所述环经1到4个Re基团取代，其中各Re如上文所定义且如本文所描述；或
(xii)或
其中各R和Re如上文所定义且如本文所描述；或
(xiii)具有0到2个氮的6元芳香族环，其中所述环经1到4个Re基团取代，其中各Re如上文所定义且如本文所描述；或
(xiv)
其中各Re如上文所定义且如本文所描述；或
(xv)具有1到3个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的5元杂芳基环，其中所述环经1到3个Re基团取代，其中各Re如上文所定义且如本文所描述；或
(xvi)
其中各R和Re如上文所定义且如本文所描述；或
(xvii)具有0到3个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的8元到10元双环饱和、部分不饱和或芳基环，其中所述环经1到4个Re基团取代，其中Re如上文所定义且如本文所描述。
在某些实施例中，式Ia或Ib中的Y基团选自下表3中所述者，其中各波形线指示与分子剩余部分的连接点。
表3.例示性Y基团：
其中各Re独立地为适合的离去基团、NO2、CN或氧代基。
在某些实施例中，R1为-C≡CH、-C≡CCH2NH(异丙基)、-NHC(O)C≡CCH2CH3、-CH2-C≡C-CH3、-C≡CCH2OH、-CH2C(O)C≡CH、-C(O)C≡CH或-CH2OC(＝O)C≡CH。在一些实施例中，R1选自-NHC(O)CH＝CH2、-NHC(O)CH＝CHCH2N(CH3)2或-CH2NHC(O)CH＝CH2。
在某些实施例中，R1选自下表4中所述者，其中各波形线指示与分子剩余部分的连接点。
表4：例示性R 1 基团
或
其中各Re独立地为适合的离去基团、NO2、CN或氧代基。
如上文大体上所定义，R1为弹头基团，或当R1和Rx形成环时，则-Q-Z为弹头基团。不希望受任何特定理论的束缚，相信所述R1基团(即弹头基团)特别适于共价结合于某些蛋白激酶的结合域中的关键半胱氨酸残基。所属领域的一般技术人员已知在结合域中具有半胱氨酸残基的蛋白激酶，且其包括ErbB1、ErbB2和ErbB4，或其突变体。在某些实施例中，本发明化合物具有弹头基团，其特征在于，本发明化合物靶向以下一个或一个以上半胱氨酸残基：
ERBB1ITQLMPFGCLLDYVREH
ERBB2VTQLMPYGCLLDHVREN
ERBB4VTQLMPHGCLLEYVHEH
因此，在一些实施例中，R1的特征在于，-L-Y部分能够共价结合于半胱氨酸残基，由此不可逆抑制酶。在某些实施例中，半胱氨酸残基为ErbB1中的Cys797、ErbB2中的Cys805和ErbB4中的Cys803，或其突变体，其中所提供的残基编号是根据Uniprot蛋白数据库(ErbB1的代码为POO533；ErbB2代码为PO4626；且ErbB4为Q15303)。应了解，视亲本序列是否含有信号肽而定，ErbB1(EGFR)中的Cys可变化地称为773或797。因此，根据本发明，ErbB1中的相关半胱氨酸残基可描述为Cys 773或Cys 797，而且这些术语可互换使用。
所属领域的一般技术人员将认识到，本文所定义的多种弹头基团都适于所述共价键结。所述R1基团包括(但不限于)本文中描述且下文表3中描述的基团。
如上文式I-a和I-b中所述，R1弹头基团可位于邻位、间位或对位。在某些实施例中，R1弹头基团相对于分子的剩余部分位于苯环的间位。
在某些实施例中，R1的特征在于，-L-Y部分能够共价结合于TEC的半胱氨酸残基，由此不可逆抑制所述酶。在一些实施例中，所述半胱氨酸残基为Cys 449。
在某些实施例中，R1的特征在于，-L-Y部分能够共价结合于BTK的半胱氨酸残基，由此不可逆抑制所述酶。在一些实施例中，所述半胱氨酸残基为Cys 481。
在某些实施例中，R1的特征在于，-L-Y部分能够共价结合于ITK的半胱氨酸残基，由此不可逆抑制所述酶。在一些实施例中，所述半胱氨酸残基为Cys 442。
在某些实施例中，R1的特征在于，-L-Y部分能够共价结合于BMX的半胱氨酸残基，由此不可逆抑制所述酶。在一些实施例中，所述半胱氨酸残基为Cys 496。
在某些实施例中，R1的特征在于，-L-Y部分能够共价结合于JAK3的半胱氨酸残基，由此不可逆抑制所述酶。在一些实施例中，所述半胱氨酸残基为Cys 909。
在某些实施例中，R1的特征在于，-L-Y部分能够共价结合于TXK的半胱氨酸残基，由此不可逆抑制所述酶。在一些实施例中，所述半胱氨酸残基为Cys 350。
所属领域的一般技术人员将认识到，本文所定义的多种弹头基团都适于所述共价键结。所述R1基团包括(但不限于)本文中描述且下文表3中描述的基团。
例示性本发明化合物陈述于下表5中。
表5.例示性化合物
在某些实施例中，本发明提供上表5中所述的任何化合物，或其医药学上可接受的盐。
在某些实施例中，本发明提供选自以下的化合物：
或其医药学上可接受的盐。
如本文所述，本发明化合物是ErbB1、ErbB2、ErbB3和ErbB4中至少一种或其突变体的不可逆抑制剂。在一些实施例中，所提供的化合物是TEC激酶(例如BTK)和JAK3的不可逆抑制剂。所属领域的一般技术人员将认识到，本发明的某些化合物是可逆抑制剂。在某些实施例中，所述化合物适用作分析比较剂化合物。在其它实施例中，所述可逆化合物适用作ErbB1、ErbB2、ErbB3、ErbB4、TEC激酶和/或JAK3或其突变体的抑制剂，并因此适用于治疗本文所述的一种或一种以上病症。本发明的一种例示性可逆化合物具有以下结构。
或其医药学上可接受的盐。
4.使用、调配物和投药
医药学上可接受的组合物
根据另一实施例，本发明提供一种组合物，其包含本发明化合物或其医药学上可接受的衍生物以及医药学上可接受的载剂、佐剂或媒剂。本发明组合物中化合物的量应能有效地可测量地抑制生物样品中或患者体内的蛋白激酶，尤其是ErbB1、ErbB2、ErbB3、ErbB4、TEC激酶和/或JAK3中的至少一者，或其突变体。在某些实施例中，本发明组合物中化合物的量应能有效地可测量地抑制生物样品中或患者体内的ErbB1、ErbB2、ErbB3、ErbB4、TEC激酶和/或JAK3中的至少一者，或其突变体。在某些实施例中，本发明组合物经调配用于投予需要所述组合物的患者。在一些实施例中，本发明组合物经调配用于经口投予患者。
本文使用的术语“患者”是指动物，优选哺乳动物，且最优选人类。
术语“医药学上可接受的载剂、佐剂或媒剂”是指不会破坏用其调配的化合物的药理学活性的无毒载剂、佐剂或媒剂。可用于本发明组合物中的医药学上可接受的载剂、佐剂或媒剂包括(但不限于)离子交换剂；氧化铝；硬脂酸铝；卵磷脂；血清蛋白，例如人类血清白蛋白；缓冲物质，例如磷酸盐、甘氨酸；山梨酸；山梨酸钾；饱和植物脂肪酸的偏甘油酯混合物；水；盐或电解质，例如硫酸钾、磷酸氢二钠、磷酸氢钾、氯化钠、锌盐；硅胶；三硅酸镁；聚乙烯吡咯烷酮；基于纤维素的物质；聚乙二醇；羧甲基纤维素钠；聚丙烯酸酯；蜡；聚乙烯-聚氧丙烯嵌段聚合物；聚乙二醇；和羊毛脂。
“医药学上可接受的衍生物”是指本发明化合物的任何无毒盐、酯、酯盐或其它衍生物，其在投予接受者后能够直接或间接提供本发明化合物，或其抑制活性代谢物或残余物。
本文使用的术语“其抑制活性代谢物或残余物”是指也作为ErbB1、ErbB2、ErbB3、ErbB4、TEC激酶和/或JAK3中至少一者或其突变体的抑制剂的其代谢物或残余物。
本发明组合物可经口、不经肠、借助吸入喷雾、局部、直肠、鼻、颊、阴道或经由植入的储积器投予。本文使用的术语“不经肠”包括皮下、静脉内、肌肉内、关节内、滑膜内、胸骨内、鞘内、肝内、病灶内和颅内注射或输注技术。优选经口、腹膜内或静脉内投予所述组合物。本发明组合物的无菌可注射形式可为水性或油性悬浮液。这些悬浮液可根据所属领域中已知的技术，使用适合的分散剂或润湿剂和悬浮剂调配。无菌可注射制剂也可为于无毒不经肠可接受的稀释剂或溶剂中形成的无菌可注射溶液或悬浮液，例如1,3-丁二醇溶液。可使用的可接受的媒剂和溶剂包括水、林格氏溶液(Ringer's solution)和等渗氯化钠溶液。此外，通常使用无菌不挥发性油作为溶剂或悬浮介质。
为此，可以使用包括合成单酸甘油酯或二酸甘油酯在内的任何温和的不挥发性油。脂肪酸(例如油酸和其三酸甘油酯衍生物)以及天然的医药学上可接受的油(例如橄榄油或蓖麻油)、尤其是其聚氧乙基化形式都可用于制备可注射剂。这些油溶液或悬浮液也可含有常用于调配医药学上可接受的剂型(包括乳液和悬浮液)的长链醇稀释剂或分散剂，例如羧甲基纤维素或类似分散剂。出于调配的目的，也可使用常用于制造医药学上可接受的固体、液体或其它剂型的其它常用表面活性剂，例如Tween系列、Span系列以及其它乳化剂或生物利用率增强剂。
本发明的医药学上可接受的组合物可以任何口服可接受的剂型经口投予，包括(但不限于)胶囊、片剂、水性悬浮液或溶液。在口服使用的片剂的情况下，常用载剂包括乳糖和玉米淀粉。通常还添加润滑剂，例如硬脂酸镁。对于以胶囊形式经口投予，适用的稀释剂包括乳糖和干燥的玉米淀粉。当需要口服使用水性悬浮液时，将活性成分与乳化剂和悬浮剂组合。必要时，也可添加某些甜味剂、调味剂或着色剂。
或者，可以利用供直肠投药的栓剂形式投予本发明的医药学上可接受的组合物。其可通过将药剂与适合的非刺激性赋形剂混合制备而成，所述赋形剂在室温下为固体，但在直肠温度下呈液体，并因此将在直肠中熔融从而释放出药物。所述物质包括可可脂、蜂蜡和聚乙二醇。
本发明的医药学上可接受的组合物也可局部投予，尤其当治疗目标包括易于借助局部施用接近的区域或器官，包括眼睛、皮肤或下肠道的疾病。易于制备适于每一所述区域或器官的局部调配物。
可以直肠栓剂调配物(参看上文)或适合的灌肠剂调配物实现对下肠道的局部施用。也可以使用局部透皮贴片。
对于局部施用，可将所提供的医药学上可接受的组合物调配成含有活性组分悬浮或溶解于一种或一种以上载剂中的适当油膏。供局部投予本发明化合物的载剂包括(但不限于)矿物油、液体矿脂、白矿脂、丙二醇、聚氧乙烯、聚氧丙烯化合物、乳化蜡和水。或者，可将所提供的医药学上可接受的组合物调配成含有活性组分悬浮或溶解于一种或一种以上医药学上可接受的载剂中的适当洗液或乳膏。适合的载剂包括(但不限于)矿物油、脱水山梨糖醇单硬脂酸酯、聚山梨醇酯60、鲸蜡酯蜡、鲸蜡硬脂醇、2-辛基十二醇、苯甲醇和水。
对于眼部使用，可于等渗、pH值经调节的无菌生理盐水中将所提供的医药学上可接受的组合物调配为微粉化悬浮液，或优选在含有或不含防腐剂(例如氯苄烷铵)的等渗、pH值经调节的无菌生理盐水中调配为溶液。或者，对于眼部使用，可将医药学上可接受的组合物调配于油膏(例如矿脂)中。
本发明的医药学上可接受的组合物也可经由鼻气雾剂或经吸入投予。所述组合物可根据医药调配领域中众所周知的技术制备，而且可在生理盐水中，使用苯甲醇或其它适合的防腐剂、用于增强生物利用率的吸收促进剂、碳氟化合物和/或其它常规增溶剂或分散剂，将其制备成溶液。
最优选将本发明的医药学上可接受的组合物调配用于经口投药。
可与载剂物质组合产生呈单一剂型的组合物的本发明化合物的量将视所治疗的宿主、特定投药模式而变化。优选所提供的组合物应调配成能对接收这些组合物的患者投予介于每天每公斤体重0.01到100mg之间剂量的抑制剂。
还应了解，用于任何特定患者的具体剂量和治疗方案将视多种因素而定，包括所用特定化合物的活性、年龄、体重、一般健康状况、性别、饮食、投药时间、排泄速率、药物组合和治疗医师的判断，以及所治疗的特定疾病的严重程度。组合物中本发明化合物的量也应视组合物中的特定化合物而定。
化合物和医药学上可接受的组合物的用途
一般说来，本文描述的化合物和组合物适用于抑制一种或一种以上酶的蛋白激酶活性。
抗药性是靶向疗法的一大难题。举例来说，已经报导了针对和以及若干种正在研究中的其它激酶抑制剂的抗药性。此外，还报导了关于cKit和PDGFR受体的抗药性。据报导，不可逆抑制剂可有效对抗蛋白激酶的抗药性形式(E.L.卡瓦科(Kwak,E.L.),R.索德拉(R.Sordella)等人,(2005)."EGF受体的不可逆抑制剂可防止针对吉非替尼的获得性耐药的发生(Irreversible inhibitors of the EGF receptor maycircumvent acquired resistance to gefitinib)."美国科学院院刊(PNAS)102(21):7665-7670。)不希望受任何特定理论的束缚，相信本发明化合物可为蛋白激酶的耐药形式的有效抑制剂。
本文使用的术语“临床抗药性”是指因药物目标突变而导致的所述药物目标对药物治疗的易感性的丧失。
本文使用的术语“抗性”是指编码目标蛋白质的野生型核酸序列和/或所述目标的蛋白质序列的改变，这些改变会降低或消除抑制剂对目标蛋白质的抑制作用。
受本文描述的化合物和组合物抑制且本文描述的方法将适用的激酶的实例包括ErbB1、ErbB2、ErbB3、ErbB4或TEC激酶(包括BTK、ITK、TEC、BMX和RLK)和/或JAK3，或其突变体。
可在活体外、活体内或在细胞系中分析本发明所用化合物作为ErbB1、ErbB2、ErbB3、ErbB4、TEC激酶和/或JAK3或其突变体的抑制剂的活性。活体外分析包括用于测定对磷酸化活性和/或随后的功能性结果，或者活化的ErbB1、ErbB2、ErbB3、ErbB4、TEC激酶和/或JAK3或其突变体的ATP酶活性的抑制的分析。另外，活体外分析还将定量抑制剂结合于ErbB1、ErbB2、ErbB3、ErbB4、TEC激酶和/或JAK3的能力。抑制剂结合可通过以下步骤测量：在结合前对抑制剂进行放射性标记，分离出抑制剂/ErbB1、抑制剂/ErbB2、抑制剂/ErbB3、抑制剂/ErbB4、抑制剂/TEC激酶(即TEC、BTK、ITK、RLK和BMX)或抑制剂/JAK3复合物，并测定结合的放射性标记的量。或者，可执行竞争实验，通过将新抑制剂与结合于已知的放射性配体的ErbB1、ErbB2、ErbB3、ErbB4、TEC激酶和/或JAK3一起培育，来测定抑制剂结合。有关分析作为ErbB1、ErbB2、ErbB3、ErbB4、TEC激酶和/或JAK3或其突变体的抑制剂的本发明所用化合物的详细条件将于下文的实例中陈述。
蛋白质酪氨酸激酶是一类催化磷酸基团从ATP或GTP转移到位于蛋白质底物上的酪氨酸残基的酶。受体酪氨酸激酶通过经由磷酸化事件活化第二信使效应物，由此将来自细胞外部的信号传输到细胞内部而起作用。这些信号将促进多种细胞过程，包括增殖、碳水化合物利用、蛋白质合成、血管生成、细胞生长和细胞存活。
(a)ErbB家族
ErbB受体是受体酪氨酸激酶的主要家族，由细胞外配体结合域、单一跨膜域和具有酪氨酸激酶活性的细胞内域构成。ErbB家族包含ErbB1(常称为EGFR)、ErbB2(常称为HER2或neu)、ErbB3(常称为HER3)和ErbB4(常称为HER4)。已经鉴别出各种受体家族成员的超过10种配体(包括EGF、TGFα、AR、BTC、EPR、HB-EGF、NRG-1、NRG-2、NRG-3、NRG-4)。当结合细胞外域的配体经历构象变化时，使得其与ErbB家族的其它成员形成均二聚体或杂二聚体。二聚作用诱导细胞内域中用作衔接蛋白和下游效应物的停泊位点的特定残基的酪氨酸磷酸化。在一些情况下，磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)和丝裂原活化蛋白激酶路径发生活化，使细胞增殖和存活(林N.U.(Lin,N.U.)；E.P.维特(Winer,E.P.),乳癌研究(Breast Cancer Res)6:204-210,2004)。
ErbB2(其配体未知)和ErbB3(无激酶活性)的缺乏将迫使各家族成员之间发生相互作用。EGFR、ErbB3和ErbB4结合配体以诱导ErbB受体发生均二聚化或杂二聚化，而ErbB2起优选的二聚化搭配物的作用。成对组合的组成对于信号多样化很重要，因为二聚体的特性将确定活化何种下游路径。ErbB信号转导路径中的代表性下游基因产物包括Shc、Grb2、SOS1、Ras、Raf1、Mek、ERK1、ERK2、ERα、Akt、mTOR、FKHR、p27、细胞周期素D1(Cyclin D1)、FasL、GSK-3、Bad和STAT3。
曾经出现过人类癌症中牵涉到ErbB家族的EGFR和其它成员的先例，因为所有实体肿瘤中超过60％过度表达这些蛋白质或其配体中的至少一者。据报导，在超过78％的乳房癌中存在具有组成性活性的致瘤的EGFR vIII(具有截短的细胞外域的突变体)，而且也曾在成胶质细胞瘤中发现这种突变体。常在乳房肿瘤、肺肿瘤、头颈肿瘤、膀胱肿瘤中发现EGFR的过度表达，而ErbB2表达常常在人类的表皮起源的肿瘤中增加。已经在患有非小细胞肺癌的患者中鉴别出酪氨酸激酶域中的活化突变(N.U.林；E.P.维特,乳癌研究,6:204-210,2004)。而ErbB1和/或ErbB2的扩增也在鳞状细胞癌、唾液腺癌、卵巢癌和胰腺癌中有所牵涉(G.C.库普(Cooper,G.C.)致癌基因(Oncogenes.)第2版,萨德伯里(Sudbury):琼斯(Jones)和巴雷特(Barlett),1995；张Y.(Zhang,Y.)等人,癌症研究(Cancer Res)66:1025-32,2006)。ErbB2的过度表达具有有效的转化活性，这可能是因为其能够与其它ErbB受体协作(L.谢尔曼(Sherman,L.)等人,致癌基因(Oncogene)18:6692-99,1999)。事实上，一些过度表达EGFR和ErbB2的人类癌症的预后不如只过度表达任一受体的癌症。
ErbB信号传导网络一般是乳癌发病机理的一个关键组成部分。ErbB2的扩增与侵袭性的肿瘤表型相关联，这种表型的特征为：肿瘤生长相对较快、转移性扩散到内脏部位、和抗药性。在20％的腋淋巴结阴性(“ANN”)乳癌病例中显示出ErbB2扩增，而且此扩增已经被鉴别为导致ANN乳癌复发风险的一个独立的预后因素。(I.L.安德烈斯(Andrulis,I.L.)等人,临床肿瘤学杂志(J Clin Oncol)16:1340-9,1998)。
经证实，利用曲妥珠单抗(trastuzumab)(赫赛汀(Herceptin)，一种针对ErbB2的单克隆抗体)靶向阻断ErbB的信号传导，可提高患有ErbB2阳性晚期乳癌的女性的存活率。针对ErbB受体的其它单克隆抗体包括西妥昔单抗(cetuximab)(艾比特思(Erbitux))和盘尼图单抗(panitumumab)(维克替比(Vectibix))。
已经发现若干种小分子酪氨酸激酶抑制剂(TKI)可选择性作用于ErbB家族成员。值得关注的实例包括吉非替尼(gefitinib)(易瑞沙(Iressa))和尔洛替尼(erlotinib)(特罗凯(Tarceva))，二者都靶向EGFR。这些小分子与ATP竞争与受体激酶域的结合。与单克隆抗体相比，TKI有几个优势：其为口服生物可利用的，耐受性良好，而且似乎在体外对ErbB2和EGFR受体的截短形式(例如EGFR vIII)具有活性。此外，小分子TKI的尺寸小，使得其能够渗透受到庇护的部位，例如中枢神经系统。最后，ErbB受体激酶域之间的同源性允许开发出同时靶向超过一个ErbB家族成员的TKI，这些优势将于本文中予以描述。
尽管某些恶性疾病与个别受体的过度表达有关，但高效的信号转导取决于ErbB受体家族成员的共表达。ErbB受体家族成员在信号转导和恶性疾病转化方面的这种协作将限制癌症治疗中的药剂成功靶向个别受体；针对靶向单一ErbB受体的药剂的潜在抗药性机制是所述受体家族其它成员的上调(C.D.布瑞特(Britten,C.D.),分子癌症治疗学(MolCancer Ther)3:1335-42,2004)。
靶向两种或两种以上ErbB受体的药剂称为泛ErbB调节剂。ERRP是在大部分良性胰腺导管上皮和胰岛细胞中表达的泛ErbB负性调节剂。人们发现，肿瘤将经历ERRP表达的进行性丧失。艾比特思和赫赛汀在有限的患者基础上(EGFR或ErbB2的表达增加的肿瘤)中取得成功部分是因为多个ErbB家族成员的共表达。
在活体外和活体内模型中，使用双ErbB方法的策略的抗肿瘤活性似乎比靶向单一ErbB受体的药剂强。因此，靶向多个ErbB家族成员的药剂可能为更广泛的患者群体提供治疗益处(张Y.(Zhang,Y.)等人,癌症研究(Cancer Res)66:1025-32,2006)。在某些实施例中，所提供的化合物将抑制ErbB1、ErbB2、ErbB3和ErbB4中的一者或多者。在一些实施例中，所提供的化合物将抑制ErbB1、ErbB2、ErbB3和ErbB4或其突变体中的两者或两者以上，并因此为泛ErbB抑制剂。
很明显，越来越多的证据支持在癌症疗法中同时抑制两个或两个以上ErbB(即泛ErbB)受体。利用小分子进行的可能的泛ErbB方法包括使用靶向个别ErbB受体的药剂的组合、使用靶向多个ErbB受体的单一药剂或使用干扰ErbB受体相互作用(例如二聚化)的药剂。其它策略包括利用小分子与抗体或化学预防疗法的组合(林N.U.(Lin,N.U.)；E.P.维特(Winer,E.P.),乳癌研究(Breast Cancer Res)6:204-210,2004)。
小分子泛ErbB抑制的实例为CI-1033，其为共价结合于细胞内激酶域的ATP结合位点的不可逆泛ErbB抑制剂。另一不可逆泛ErbB受体酪氨酸激酶抑制剂为HKI-272，其将抑制培养物和异种移植物中表达ErbB-1(EGFR)和ErbB-2(HER-2)的肿瘤细胞的生长，并且在HER-2阳性乳癌中具有抗肿瘤活性(I.L.安德烈斯(Andrulis,I.L.)等人,临床肿瘤学杂志(J Clin Oncol)16:1340-9,1998)。与可逆抑制剂相比较，不可逆抑制剂已经显示出优良的抗肿瘤活性。
I型神经纤维瘤病(NF1)是一种显性遗传的人类疾病，每2500-3500位个体中就有一人患此病。若干个器官系统受到影响，包括骨骼、皮肤、虹膜和中枢神经系统，如在学习障碍和神经胶质瘤中所表现。NF1的特点是周围神经系统出现良性肿瘤(神经纤维瘤)，其数量和尺寸随患者而差异极大。神经纤维瘤是由许旺氏细胞(Schwann cell)、神经元、成纤维细胞和其它细胞构成的异质肿瘤，其中许旺氏细胞为主要(60-80％)细胞类型。
EGFR的异常表达与NF1中和NF1动物模型中肿瘤的发展有关，表明其在发病机理中的作用，而且提出一种新颖的潜在治疗目标。在EGF不是驱动细胞生长的主要因子的情况下，EGFR的表达会影响来源于NF1患者的肿瘤细胞系的生长。这些数据表明，EGFR可在NF1肿瘤发生和许旺氏细胞转化中起重要作用(J.E.德克鲁(DeClue,J.E.)等人,临床研究杂志(JClin Invest)105:1233-41,2000)。
NF1患者将发展侵袭性许旺氏细胞赘瘤，称为恶性周围神经鞘瘤(MPNST)。许旺氏细胞是周围神经系统中的主要支持细胞群。这些赘瘤中的赘生性许旺氏细胞可变地表达介导NRG-1反应的ErbB酪氨酸激酶(ErbB2、ErbB3、ErbB4)。神经调节蛋白-1(neuregulin-1，NRG-1)蛋白质会促进正在发育的神经系统中许多细胞类型的分化、存活和/或增殖，而且NRG-1在形成髓鞘的许旺氏细胞中的过度表达将诱导形成恶性周围神经鞘瘤(MPNST)(K.B.佛伦(Fallon,K.B.)等人,神经肿瘤学杂志(J Neuro Oncol)66:273-84,2004)。
许旺氏细胞生长的失调是驱使I型神经纤维瘤病(NF1)患者发展良性神经纤维瘤和MPNST的主要缺陷。MPNST和转化的小鼠许旺氏细胞的活体外生长高度依赖于EGF，而且在EGF是主要生长因子的情况下，可由EGFR抑制剂阻断。人们发现，一些人类MPNST细胞系显示出组成型ErbB磷酸化。尽管用ErbB抑制剂治疗将消除ErbB磷酸化并减少这些细胞系中的DNA合成，但仍难以获得针对MPNST的有效化疗方案(M.S.斯通塞弗(Stonecypher,M.S.)等人,致癌基因(Oncogene)24:5589-5605,2005)。
许旺细胞瘤(Schwannoma)是周围神经肿瘤，其几乎全部是由类许旺氏细胞构成，而且通常在II型神经纤维瘤病(NF2)肿瘤抑制基因中具有突变。90％的NF2患者会发展双侧前庭许旺细胞瘤和/或脊椎许旺细胞瘤。扩大的许旺细胞瘤可压挤相邻的结构，导致失聪和其它神经问题。这些肿瘤难以用手术去除，常会导致患者死亡率的增加。
正常的人类许旺氏细胞和许旺细胞瘤细胞都表达神经调节蛋白受体(即ErbB受体)，而且许旺细胞瘤细胞会对神经调节蛋白反应而增殖。异常的神经调节蛋白产生或反应有可能引起异常的许旺细胞瘤细胞增殖(P.D.派利顿(Pelton,P.D.)等人,致癌基因(Oncogene)17:2195-2209,1998)。
NF2肿瘤抑制因子默林(Merlin)是一种参与酪氨酸激酶活性调控的膜/细胞骨架相关蛋白。人们已经在果蝇(Drosophila)中证明了默林突变与EGFR路径突变之间的遗传相互作用(D.R.拉热奈斯(LaJeunesse,D.R.)等人,遗传学(Genetics)158:667-79,2001)。其它证据表明，在细胞与细胞接触时，默林可通过限制EGFR进入膜区室，致使其不能传导信号和发生内化，来抑制EGFR的内化和信号传导(A.I.麦克考雷斯(McClatchey,A.I.)等人,基因与发育(Genes and Development)19:2265-77,2005；M.C克图(Curto,M.C)等人,细胞生物学杂志(J Cell Biol)177:893-903,2007)。
本文使用的术语“治疗(treatment、treat和treating)”是指逆转、减轻本文描述的疾病或病症或者其一种或一种以上症状，延迟其发作，或者抑制其进展。在一些实施例中，治疗可在显现出一种或一种以上症状之后投予。在其它实施例中，治疗可在无症状的情况下投予。例如，可在症状发作之前(即，根据症状史和/或根据遗传或其它易感因素)对易感个体投予治疗。治疗也可在症状消失后持续投予，例如以预防或延迟其复发。
所提供的化合物是ErbB1、ErbB2、ErbB3和ErbB4中一者或多者的抑制剂，并因此适用于治疗一种或一种以上与ErbB1、ErbB2、ErbB3和ErbB4中一者或多者的活性有关的病症。因此，在某些实施例中，本发明提供一种治疗ErbB1介导的、ErbB2介导的、ErbB3介导的和/或ErbB4介导的病症的方法，其包含对有需要的患者投予本发明化合物或其医药学上可接受的组合物的步骤。
本文使用的术语“ErbB1介导的”、“ErbB2介导的”、“ErbB3介导的”和/或“ErbB4介导的”病症或病状在本文中用于指已知ErbB1、ErbB2、ErbB3和/或ErbB4或其突变体中的一者或多者在其中起作用的任何疾病或其它有害病状。因此，本发明另一实施例涉及治疗已知ErbB1、ErbB2、ErbB3和/或ErbB4或其突变体中的一者或多者在其中起作用的一种或一种以上疾病，或减轻所述疾病的严重程度。具体地说，本发明涉及一种治疗选自增生性病症的疾病或病状或减轻其严重程度的方法，其中所述方法包含对有需要的患者投予本发明的化合物或组合物。
在一些实施例中，本发明提供一种治疗一种或一种以上选自癌症的病症或减轻其严重程度的方法。在一些实施例中，所述癌症与实体肿瘤有关。在某些实施例中，所述癌症是乳癌、成胶质细胞瘤、肺癌、头颈癌、结肠直肠癌、膀胱癌或非小细胞肺癌。在一些实施例中，本发明提供一种治疗一种或一种以上选自鳞状细胞癌、唾液腺癌、卵巢癌或胰腺癌的病症或减轻其严重程度的方法。
在某些实施例中，本发明提供一种治疗I型神经纤维瘤病(NF1)、II型神经纤维瘤病(NF2)、许旺氏细胞赘瘤(例如MPNST)或许旺细胞瘤或减轻其严重程度的方法。
(b)TEC家族
非受体酪氨酸激酶的TEC家族(本文中称为“TEC激酶”)在通过抗原-受体(例如TCR、BCR和Fc受体)进行的信号传导中起关键作用(评述于：A米勒(Miller A)等人,免疫学新观点(Current Opinion in Immunology)14；331-340(2002))。TEC激酶对于T细胞活化至关重要。TEC家族的三个成员Itk、Rlk和在T细胞中的抗原受体接合下游活化，并将信号传输到下游效应物，包括PLC-γ。小鼠中Itk和Rlk的组合缺失导致对包括增殖、细胞因子产生和针对细胞内寄生虫(刚地弓形虫(Toxoplasma gondii))的免疫反应在内的TCR反应的完全抑制(斯查夫(Schaeffer)等人,科学(Science)284；638-641(1999))。在TCR接合后，ITK/RLK缺陷型T细胞中实现细胞内信号传导；三磷酸肌醇产生、钙动员和MAP激酶活化都减少。Tec激酶对于B细胞发育和活化也很重要。
TEC激酶包括5个家族成员，其主要在造血细胞中表达：TEC、BTK、ITK(也称为TSK和EMT)、RLK(也称为TXK)和BMX(也称为ETK)。在黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)、斑马鱼(zebrafish/Danio rerió)、鳐鱼(晶吻鳐(Raja eglanteria))和海胆(紫海胆(Anthocidaris crassispina))中还发现了其它相关的TEC激酶。
所提供的化合物是一种或一种以上TEC激酶的抑制剂，并因此适用于治疗一种或一种以上与一种或一种以上TEC激酶的活性有关的病症。因此，在某些实施例中，本发明提供一种治疗TEC介导的病症的方法，其包含对有需要的患者投予本发明化合物或其医药学上可接受的组合物的步骤。
本文使用的术语“TEC介导的病状”是指已知TEC激酶在其中起作用的任何疾病或其它有害病状。所述病状包括本文以及M梅尔切(Melcher,M)等人于"TEC家族激酶在发炎过程中的作用(The Role of TEC Family Kinases in Inflammatory Processes)",药物化学中的消炎与抗过敏剂(Anti-Inflammatory&Anti-Allergy Agents in MedicinalChemistry),第6卷,第1期,第61-69页(2007年2月)中描述者。因此，本发明另一实施例涉及治疗已知TEC激酶在其中起作用的一种或一种以上疾病，或减轻所述疾病的严重程度。具体地说，本发明涉及一种治疗一种或一种以上选自以下的疾病或病状或者减轻其严重程度的方法：自体免疫性疾病、发炎性疾病、增生性疾病和过度增生性疾病，以及免疫介导的疾病，包括移植的器官或组织的排斥反应和获得性免疫缺陷综合症(AIDS)(也称为HIV)，其中所述方法包含对有需要的患者投予本发明的组合物。
在一些实施例中，本发明提供一种治疗一种或一种以上与TEC激酶相关的疾病和病状或减轻其严重程度的方法，所述疾病和病状包括呼吸道疾病，包括(但不限于)可逆阻塞性气道疾病，包括哮喘，例如支气管哮喘、过敏性哮喘、内因性哮喘、外因性哮喘和尘埃性哮喘，尤其是慢性或顽固性哮喘(例如晚期哮喘的气道高反应性)和支气管炎。在一些实施例中，本发明提供一种治疗一种或一种以上与TEC激酶相关的疾病和病状或者减轻其严重程度的方法，所述疾病和病状包括以鼻粘膜发炎为特征的病状，包括急性鼻炎、过敏性鼻炎、萎缩性鼻炎，和慢性鼻炎，包括干酪性鼻炎、肥厚性鼻炎、化脓性鼻炎、干燥性鼻炎和药物性鼻炎；膜性鼻炎，包括格鲁布性鼻炎(croupous rhinitis)、纤维蛋白性鼻炎和假膜性鼻炎，和结核性鼻炎、季节性鼻炎，包括神经性鼻炎(干草热)和血管运动性鼻炎、肉状瘤病、农民肺和相关疾病、纤维性肺和特发性间质性肺炎。
在一些实施例中，本发明提供一种治疗一种或一种以上与TEC激酶相关的疾病和病状或者减轻其严重程度的方法，所述疾病和病状包括骨骼和关节疾病，包括(但不限于)类风湿性关节炎、血清阴性脊柱关节病(包括强直性脊柱炎、牛皮癣性关节炎和赖特尔氏病(Reiter's disease))、贝赫切特氏病(Behcet's disease)、修格连氏综合症(Sjogren'ssyndrome)、全身性硬化病、骨质疏松症、骨癌和骨转移。
在一些实施例中，本发明提供一种治疗一种或一种以上与TEC激酶相关的疾病和病状或者减轻其严重程度的方法，所述疾病和病状包括皮肤疾病和病症，包括(但不限于)牛皮癣、全身性硬化病、异位性皮炎、接触性皮炎和其它湿疹性皮炎、脂溢性皮炎、扁平苔藓、天疱疮、大疱性天疱疮、大疱性表皮松解症、荨麻疹、血管瘤、血管炎、红斑、皮肤嗜酸性粒细胞增多症、葡萄膜炎、斑秃和春季结膜炎。
在一些实施例中，本发明提供一种治疗一种或一种以上与TEC激酶相关的疾病和病状或者减轻其严重程度的方法，所述疾病和病状包括胃肠道疾病和病症，包括(但不限于)乳糜泻、直肠炎、嗜酸性粒细胞性胃肠炎、肥大细胞增多症、胰腺炎、克隆氏病(Crohn'sdisease)、溃疡性结肠炎，影响远离内脏的食物相关性过敏症，例如偏头痛、鼻炎和湿疹。
在一些实施例中，本发明提供一种治疗一种或一种以上与TEC激酶相关的疾病和病状或者减轻其严重程度的方法，所述疾病和病状包括其它组织的疾病和病症以及全身性疾病，包括(但不限于)多发性硬化症、动脉粥样硬化、红斑狼疮、全身性红斑狼疮、桥本氏甲状腺炎(Hashimoto's thyroiditis)、重症肌无力、糖尿病、肾病综合症、嗜酸性粒细胞增多性筋膜炎、高IgE综合症、瘤型麻风病、塞扎里综合症(sezary syndrome)和特发性血小板减少性紫癜、血管成形术后再狭窄、肿瘤(例如白血病、淋巴瘤和前列腺癌)和动脉粥样硬化。在某些实施例中，糖尿病是I型糖尿病。
在一些实施例中，本发明提供一种治疗一种或一种以上与TEC激酶相关的疾病和病状或者减轻其严重程度的方法，所述疾病和病状包括同种异体移植物排斥反应，包括(但不限于)例如肾、心脏、肝、肺、骨髓、皮肤和角膜移植后的急性和慢性同种异体移植物排斥反应；和慢性移植物抗宿主疾病。
在一些实施例中，本发明涉及一种治疗一种或一种以上如上文所述的与TEC激酶相关的疾病或病状或者减轻其严重程度的方法，其中所述方法包含对有需要的患者投予本发明的化合物或组合物。
(c)布鲁顿氏酪氨酸激酶(Bruton's tyrosine kinase，BTK)
布鲁顿氏酪氨酸激酶(“BTK”)(TEC激酶的一个成员)是在除T淋巴细胞和自然杀手细胞外的所有造血细胞类型中表达的关键信号传导酶。BTK在B细胞信号传导路径中起不可或缺的作用，将细胞表面B细胞受体(BCR)刺激与下游细胞内反应关联起来。
BTK是B细胞发育、活化、信号传导和存活的关键调节剂(黑崎(Kurosaki),免疫学新观点(Curr Op Imm),2000,276-281；斯契夫(Schaeffer)和斯奇沃兹伯格(Schwartzberg),免疫学新观点,2000,282-288)。此外，BTK在多个其它造血细胞信号传导路径中起作用，例如巨噬细胞中的钟样受体(Toll like receptor，TLR)和细胞因子受体介导的TNF-α产生；肥大细胞中的IgE受体(Fc_ε_RI)信号传导；B系淋巴样细胞中Fas/APO-1细胞凋亡信号传导的抑制；和胶原蛋白刺激的血小板凝集。参看例如C.A.杰弗瑞斯(C.A.Jeffries)等人,(2003),生物化学杂志(Journal of Biological Chemistry)278:26258-26264；N.J.霍伍德(N.J.Horwood)等人,(2003),实验医学杂志(The Journal ofExperimental Medicine)197:1603-1611；岩城(Iwaki)等人(2005),生物化学杂志,280(48):40261-40270；瓦斯利夫(Vassilev)等人(1999),生物化学杂志,274(3):1646-1656；和奎克(Quek)等人(1998),当前生物学(Current Biology)8(20):1137-1140。
BTK中具有突变的患者会出现B细胞发育的完全阻断，导致几乎完全没有成熟的B淋巴细胞和浆细胞、Ig含量严重减少以及针对回忆抗原的体液反应的完全抑制(评述于：维义伦(Vihinen)等人,生命科学前沿(Frontiers in Bioscience)5:d917-928)。缺乏BTK的小鼠也具有数量较少的周围B细胞和明显降低的IgM和IgG3血清含量。小鼠中BTK的缺失将对抗IgM所诱导的B细胞增殖造成深入影响，并抑制针对不依赖于胸腺的II型抗原的免疫反应(埃尔默(Ellmeier)等人,实验医学杂志(J Exp Med)192:1611-1623(2000))。BTK也在经由高亲和力IgE受体(Fc_ε_RI)进行的肥大细胞活化中起极为重要的作用。BTK缺陷型鼠类动物的肥大细胞在Fc_ε_RI交联后失调减少，而且促炎性细胞因子的产生减少(河上(Kawakami)等人,白细胞生物学杂志(Journal of Leukocyte Biology)65:286-290)。
BTK已牵涉到糖尿病中。如由无法产生抗胰岛素自体抗体所说明，非肥胖糖尿病小鼠BTK缺乏明显防止糖尿病，并改良B细胞相关性耐受性(肯达尔(Kendall)等人,免疫学杂志(J.Immunol.)183:6403-6412(2009))。因此，调节BTK和改良B细胞相关性耐受性可用于治疗糖尿病，尤其T细胞介导的自体免疫性糖尿病，例如I型糖尿病。
BTK还牵涉到各种癌症中。举例来说，与正常胰腺细胞相比较，胰腺癌细胞中BTK上调，并且在慢性胰腺炎细胞中BTK也上调，这有时是胰腺癌的前兆(科诺格雷克-杰斯维克(Crnogorac-Jurcevic)等人,胃肠病学(Gastroenterology)129:1454-1463(2005))。由于BTK在B细胞发育、活化、信号传导和存活的调控中起到关键作用，故许多B细胞相关性癌症中涉及BTK。
所提供的化合物是BTK的抑制剂，并因此适用于治疗一种或一种以上与BTK活性有关的病症。因此，在一些实施例中，本发明提供一种治疗BTK介导的病症的方法，其包含对有需要的患者投予本发明化合物或其医药学上可接受的组合物的步骤。
本文使用的术语“BTK介导的”病症或病状在本文中用于指已知BTK或其突变体在其中起作用的任何疾病或其它有害病状。因此，本发明另一实施例涉及治疗已知BTK或其突变体在其中起作用的一种或一种以上疾病，或减轻所述疾病的严重程度。具体地说，本发明涉及一种治疗选自增生性病症或自体免疫性病症的疾病或病状或者减轻其严重程度的方法，其中所述方法包含对有需要的患者投予本发明的化合物或组合物。
在一些实施例中，本发明提供一种治疗一种或一种以上与BTK有关的疾病和病状或者减轻其严重程度的方法。在一些实施例中，所述疾病或病状是自体免疫性疾病，例如发炎性肠病、关节炎、全身性红斑狼疮(SLE)、血管炎、特发性血小板减少性紫癜(ITP)、类风湿性关节炎、牛皮癣性关节炎、骨关节炎、斯蒂尔氏病(Still's disease)、幼年型关节炎、糖尿病、重症肌无力、桥本氏甲状腺炎、奥德氏甲状腺炎(Ord's thyroiditis)、格雷夫斯氏病(Graves'disease)、自体免疫性甲状腺炎、修格连氏综合症、多发性硬化症、全身性硬化病、神经莱姆病(Lyme neuroborreliosis)、格林-巴利综合症(Guillain-Barre syndrome)、急性播散性脑脊髓炎、艾迪生氏病(Addison's disease)、眼阵挛-肌阵挛综合症、强直性脊柱炎、抗磷脂抗体综合症、再生障碍性贫血、自体免疫性肝炎、自体免疫性胃炎、恶性贫血、乳糜泻、古德帕斯丘氏综合症(Goodpasture's syndrome)、特发性血小板减少性紫癜、视神经炎、硬皮病、原发性胆汁性肝硬化、赖特氏综合症、高安氏动脉炎(Takayasu's arteritis)、颞动脉炎、温抗体型自体免疫性溶血性贫血、韦格纳氏肉芽肿病(Wegener'sgranulomatosis)、牛皮癣、普秃、贝赫切特氏病、慢性疲劳、自主神经功能异常、膜性肾小球肾炎、子宫内膜异位症、间质性膀胱炎、寻常天疱疮、大疱性类天疱疮、神经性肌强直、硬皮病或外阴痛。在一些实施例中，所述疾病或病状是过度增生性疾病或免疫介导的疾病，包括移植的器官或组织的排斥反应和获得性免疫缺陷综合症(AIDS，也称为HIV)。在某些实施例中，糖尿病是I型糖尿病。
在一些实施例中，本发明提供一种治疗一种或一种以上与BTK有关的疾病和病状或者减轻其严重程度的方法，其中所述疾病或病状选自异种免疫性病状或疾病，其包括(但不限于)移植物抗宿主疾病、移植、输血、过敏性反应、过敏症(例如对植物花粉、乳胶、药物、食物、昆虫毒素、动物毛发、动物鳞屑、尘螨或蟑螂(cockroach calyx)过敏)、I型超敏反应、过敏性结膜炎、过敏性鼻炎和异位性皮炎。
在一些实施例中，本发明提供一种治疗一种或一种以上与BTK有关的疾病和病状或者减轻其严重程度的方法，其中所述疾病或病状选自发炎性疾病，例如哮喘、阑尾炎、异位性皮炎、哮喘、过敏症、睑缘炎、细支气管炎、支气管炎、滑囊炎、子宫颈炎、胆管炎、胆囊炎、慢性移植物排斥、结肠炎、结膜炎、克隆氏病、膀胱炎、泪腺炎、皮炎、皮肌炎、脑炎、心内膜炎、子宫内膜炎、肠炎、小肠结肠炎、上髁炎、附睾炎、筋膜炎、纤维组织炎、胃炎、胃肠炎、亨-舍二氏紫癜(Henoch-Schonlein purpura)、肝炎、化脓性汗腺炎、免疫球蛋白A肾病、间质性肺病、咽喉炎、乳腺炎、脑膜炎、脊髓炎、心肌炎、肌炎、肾炎、卵巢炎、睾丸炎、骨炎、耳炎、胰腺炎、腮腺炎、心包炎、腹膜炎、咽炎、胸膜炎、静脉炎、局部急性肺炎、肺炎、多肌炎、直肠炎、前列腺炎、肾盂肾炎、鼻炎、输卵管炎、鼻窦炎、口腔炎、滑膜炎、肌腱炎、扁桃体炎、溃疡性结肠炎、葡萄膜炎、阴道炎、血管炎或外阴炎。
在一些实施例中，本发明提供一种治疗一种或一种以上与BTK有关的疾病和病状或者减轻其严重程度的方法，其中所述疾病或病状选自癌症。在一个实施例中，所述癌症是B细胞增殖性病症，例如弥漫性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、慢性淋巴细胞性淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病、急性淋巴细胞白血病、B细胞前淋巴细胞白血病、淋巴浆细胞淋巴瘤/瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症(Waldenstrom macroglobulinemia)、脾边缘区淋巴瘤、多发性骨髓瘤(也称为浆细胞骨髓瘤)、非霍奇金氏淋巴瘤(non-Hodgkin's lymphoma)、霍奇金氏淋巴瘤(Hodgkin's lymphoma)、浆细胞瘤、结外边缘区B细胞淋巴瘤、结内边缘区B细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、纵隔(胸腺)大B细胞淋巴瘤、血管内大B细胞淋巴瘤、原发性渗出性淋巴瘤、伯基特氏淋巴瘤(Burkitt lymphoma)/白血病或淋巴瘤样肉芽肿病。在一些实施例中，所述癌症是乳癌、前列腺癌或肥大细胞癌(例如肥大细胞瘤、肥大细胞性白血病、肥大细胞肉瘤、全身性肥大细胞增多症)。在一个实施例中，所述癌症是骨癌。在另一实施例中，所述癌症是其它原发性起源的癌症，并转移到骨骼。在某些实施例中，癌症是结肠直肠癌或胰腺癌。
在一些实施例中，本发明提供一种治疗一种或一种以上与BTK激酶相关的疾病或病状或者减轻其严重程度的方法，所述疾病或病状包括骨骼和关节疾病，包括(但不限于)类风湿性关节炎、血清阴性脊柱关节病(包括强直性脊柱炎、牛皮癣性关节炎和赖特尔氏病)、贝赫切特氏病、修格连氏综合症、全身性硬化病、骨质疏松症、骨癌和骨转移。
在一些实施例中，本发明提供一种治疗一种或一种以上与BTK激酶相关的疾病和病状或者减轻其严重程度的方法，其中所述疾病或病状选自血栓栓塞性病症，例如心肌梗塞、心绞痛、血管成形术后再闭塞、血管成形术后再狭窄、主动脉冠状动脉分流术后再闭塞、主动脉冠状动脉分流术后再狭窄、中风、短暂性局部缺血、周围动脉闭塞性病症、肺栓塞或深静脉血栓形成。
在一些实施例中，本发明提供一种治疗一种或一种以上与BTK有关的疾病和病状或者减轻其严重程度的方法，所述疾病和病状包括感染和非感染性发炎性事件，以及自体免疫性和其它发炎性疾病。这些自体免疫性和发炎性疾病、病症和症状包括骨盆腔发炎性疾病、尿道炎、皮肤晒伤、鼻窦炎、局部急性肺炎、脑炎、脑膜炎、心肌炎、肾炎、骨髓炎、肌炎、肝炎、胃炎、肠炎、皮炎、牙龈炎、阑尾炎、胰腺炎、胆囊炎、无丙种球蛋白血症、牛皮癣、过敏症、克隆氏病、肠易激综合症、溃疡性结肠炎、修格连氏病、组织移植物排斥反应、移植的器官的超急性排斥反应、哮喘、过敏性鼻炎、慢性阻塞性肺病(COPD)、自体免疫性多腺体病(也称为自体免疫性多腺体综合症)、自体免疫性斑秃、恶性贫血、肾小球肾炎、皮肌炎、多发性硬化症、硬皮病、血管炎、自体免疫性溶血和血小板缺乏状态、古德帕斯丘氏综合症、动脉粥样硬化、艾迪生氏病、帕金森氏病(Parkinson's disease)、阿尔茨海默氏病、I型糖尿病、败血性休克、全身性红斑狼疮(SLE)、类风湿性关节炎、牛皮癣性关节炎、幼年型关节炎、骨关节炎、慢性特发性血小板减少性紫癜、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症、重症肌无力、桥本氏甲状腺炎、异位性皮炎、退化性关节病、白癜风、自体免疫性垂体机能减退、格林-巴利综合症、贝赫切特氏病、硬皮病、蕈样肉芽肿病、急性发炎性反应(例如急性呼吸窘迫综合症和局部缺血/再灌注损伤)和格雷夫斯氏病。在某些实施例中，糖尿病是I型糖尿病。
在一些实施例中，本发明提供一种治疗一种或一种以上与BTK有关的疾病和病状或者减轻其严重程度的方法，所述疾病和病状选自类风湿性关节炎、多发性硬化症、B细胞慢性淋巴细胞白血病、急性淋巴细胞白血病、毛细胞白血病、非霍奇金氏淋巴瘤、霍奇金氏淋巴瘤、多发性骨髓瘤、骨癌、骨转移、骨质疏松症、糖尿病(例如I型糖尿病)、肠易激综合症、克隆氏病、狼疮和肾移植。
(d)ITK
白细胞介素-2诱导性T细胞激酶(“ITK”)是在T细胞、肥大细胞和自然杀手细胞中表达的。其在T细胞中T细胞受体(TCR)受刺激时被活化，并且在肥大细胞中高亲和力IgE受体活化时被活化。在T细胞中，受体刺激后，Lck(Src酪氨酸激酶家族成员)将ITK的激酶域活化环中的Y511磷酸化(S.D.海耶克(S.D.Heyeck)等人,1997,生物化学杂志(J.Biol.Chem),272,25401-25408)。活化的ITK以及Zap-70为PLC-γ的磷酸化和活化所需(S.C.布奈尔(S.C.Bunnell)等人,2000,生物化学杂志,275,2219-2230)。PLC-γ催化形成1,4,5-三磷酸肌醇和二酰基甘油，从而分别引起钙动员和PKC活化。这些事件将活化多个下游路径，并最终引起细胞脱粒(肥大细胞)和细胞因子基因的表达(T细胞)(Y.河上(Y.Kawakami)等人,1999,白细胞生物学杂志(J.Leukocyte Biol),65,286-290)。
ITK在T细胞活化中所起的作用已经在ITK基因敲除小鼠中得到证实。来自ITK基因敲除小鼠的CD4+T细胞在混合淋巴细胞反应中或者在Con A或抗CD3刺激后增殖反应减弱。(廖X.C.(X.C.Liao)和D.R.利特曼(D.R.Littman),1995,免疫学(Immunity),3,757-769)。另外，来自ITK基因敲除小鼠的T细胞在TCR刺激后产生极少IL-2，使得这些细胞的增殖减少。在另一项研究中，ITK缺陷型CD4+T细胞在TCR刺激后产生较少量的细胞因子，包括IL-4、IL-5和IL-13，甚至在用诱导条件预致敏后也是如此(D.J.福威尔(D.J.Fowell),1999,免疫学(Immunity),11,399-409)。
ITK在PLC-γ活化以及在钙动员中所起的作用也在这些基因敲除小鼠的T细胞中得到证实，其在TCR刺激后IP3产生急剧减少，而且没有细胞外钙流入(刘K.(K.Liu)等人,1998,实验医学杂志(J.Exp.Med.)187,1721-1727)。这些研究证明了ITK在T细胞和肥大细胞的活化中所起的关键作用。因此，ITK抑制剂对于由这些细胞的不当活化所介导的疾病将具有治疗益处。
已得到确定的是，T细胞在调控免疫反应方面起到重要作用(鲍威尔(Powrie)和考夫曼(Coffman),1993,今日免疫学(Immunology Today),14,270-274)。事实上，T细胞活化通常是免疫性病症的起始事件。在TCR活化后，发生钙流入，而这是T细胞活化所必需的。活化后，T细胞即产生细胞因子，包括IL-2、4、5、9、10和13，从而引起T细胞增殖、分化和效应功能。利用IL-2抑制剂进行的临床研究显示，干扰T细胞活化和增殖将在活体内有效抑制免疫反应(沃德曼(Waldmann),1993,今日免疫学(Immunology Today),14,264-270)。因此，抑制T淋巴细胞活化和随后的细胞因子产生的药剂在治疗上可用于选择性抑制需要此类免疫抑制的患者的免疫反应。
肥大细胞通过释放促炎性介体和细胞因子，而在哮喘和过敏病症中起重要作用。抗原介导的Fc.ε.RI(IgE的高亲和力受体)聚集将使肥大细胞活化(D.B.考瑞(D.B.Corry)等人,1999,自然(Nature),402,B18-23)。此举将触发一系列信号传导事件，引起包括组胺、蛋白酶、白细胞三烯和细胞因子在内的介体的释放(J.R.哥顿(J.R.Gordon)等人,1990,今日免疫学,11,458-464。)这些介体引起血管渗透性增加、粘液产生、支气管收缩、组织降解和发炎，由此在哮喘和过敏病症的病原学和症状中起到关键作用。
使用ITK基因敲除小鼠得到的公开的数据表明，在无ITK功能的情况下，产生的记忆T细胞的数量将增加(A.T.米勒(A.T.Miller)等人,2002,免疫学杂志(The Journal ofImmunology),168,2163-2172)。一种改良疫苗接种方法的策略是增加所产生的记忆T细胞的数量(S.M.凯奇(S.M.Kaech)等人,免疫学自然评论(Nature Reviews Immunology),2,251-262)。此外，小鼠中缺失ITK还使T细胞受体(TCR)诱导的增殖和细胞因子IL-2、IL-4、IL-5、IL-10和IFN-y的分泌减少(斯查夫(Schaeffer)等人,科学(Science)284；638-641(1999)；福威尔(Fowell)等人,免疫学(Immunity)11,399-409(1999)；斯查夫等人,自然免疫学(Nature Immunology)2(12):1183-1188(2001))。在ITK-/-小鼠中，过敏性哮喘的免疫学症状减轻。在ITK-/-小鼠中，肺炎、嗜酸性粒细胞浸润和粘液产生回应于利用过敏原OVA进行的激发而显著减少(穆勒(Mueller)等人,免疫学杂志(Journal of Immunology)170:5056-5063(2003))。在异位性皮炎也涉及到ITK。据报导，ITK基因在来自中度和/或重度异位性皮炎患者的周围血液T细胞中的表达量高于对照组或轻度异位性皮炎患者(松本(Matsumoto)等人,国际过敏反应和免疫学文献(International Archives of Allergyand Immunology)129:327-340(2002))。
RLK-/-小鼠的脾细胞回应于TCR接合所分泌的IL-2的量是野生型动物所产生的量的一半(斯查夫等人,科学,284:638-641(1999))，而小鼠中同时缺失ITK和RLK将引起对TCR诱导的反应(包括增殖和细胞因子IL-2、IL-4、IL-5和IFN-y的产生)的完全抑制(斯查夫等人,自然免疫学,2(12):1183-1188(2001)；斯查夫等人,科学,284:638-641(1999))。在ITK/RLK缺陷型T细胞中，TCR接合后实现细胞内信号传导；而三磷酸肌醇产生、钙动员、MAP激酶活化以及转录因子NFAT和AP-1的活化都减少(斯查夫等人,科学,284:638-641(1999)；斯查夫等人,自然免疫学,2(12):1183-1188(2001))。
所提供的化合物是ITK的抑制剂，并因此适用于治疗一种或一种以上与ITK活性有关的病症。因此，在一些实施例中，本发明提供一种治疗ITK介导的病症的方法，其包含对有需要的患者投予本发明化合物或其医药学上可接受的组合物的步骤。
本文使用的术语“ITK介导的”病症或病状在本文中用于指已知ITK或其突变体在其中起作用的任何疾病或其它有害病状。因此，本发明另一实施例涉及治疗已知ITK或其突变体在其中起作用的一种或一种以上疾病，或减轻所述疾病的严重程度。具体地说，本发明涉及一种治疗选自肥大细胞介导的病状、嗜碱细胞介导的病症、免疫性或过敏性病症的疾病或病状或者减轻其严重程度的方法，其中所述方法包含对有需要的患者投予本发明的化合物或组合物。
在一些实施例中，本发明提供一种治疗一种或一种以上与ITK有关的疾病和病状或者减轻其严重程度的方法，其中所述疾病或病状是免疫性病症，包括发炎性疾病、自体免疫性疾病、器官和骨髓移植物排斥反应，以及其它与T细胞介导的免疫反应或肥大细胞介导的免疫反应有关的病症。
在某些实施例中，本发明提供一种治疗一种或一种以上与ITK有关的疾病和病状或者减轻其严重程度的方法，其中所述疾病或病状是急性或慢性发炎、过敏症、接触性皮炎、牛皮癣、类风湿性关节炎、多发性硬化症、糖尿病(例如1型糖尿病)、发炎性肠病、格林-巴利综合症、克隆氏病、溃疡性结肠炎、癌症、移植物抗宿主疾病(和器官或骨髓移植排斥反应的其它形式)或红斑狼疮。
在某些实施例中，本发明提供一种治疗一种或一种以上与ITK有关的疾病和病状或者减轻其严重程度的方法，其中所述疾病或病状是肥大细胞驱动的病状、嗜碱细胞介导的病症、可逆阻塞性气道疾病、哮喘、鼻炎、慢性阻塞性肺病(COPD)、周围T细胞淋巴瘤或HIV[也称为获得性免疫缺陷综合症(AIDS)]。所述病状包括雷丁格(Readinger)等人,美国科学院院刊(PNAS)105:6684-6689(2008)中所述者。
(e)JAK家族
詹纳斯氏激酶(Janus kinase，JAK)是由JAK1、JAK2、JAK3和TYK2组成的酪氨酸激酶家族。JAK在细胞因子信号传导中起重要作用。JAK激酶家族的下游底物包括信号转导因子及转录活化因子(signal transducer and activator of transcription，STAT)蛋白。JAK/STAT信号传导涉及许多异常免疫反应的介导，例如过敏反应、哮喘，自体免疫性疾病，例如移植物排斥反应、类风湿性关节炎、肌萎缩性侧索硬化症和多发性硬化症，以及实体和血液恶性疾病，例如白血病和淋巴瘤。JAK/STAT路径的药物干预已有评述[弗兰克(Frank),分子医学(Mol.Med.)5:432-456(1999)；和赛德尔(Seidel)等人,致癌基因(Oncogene)19:2645-2656(2000)]。
JAK1、JAK2和TYK2的表达普遍存在，而JAK3主要在造血细胞中表达。JAK3只结合于共用细胞因子受体γ链(yc)，并受IL-2、IL-4、IL-7、IL-9和IL-15活化。
事实上，人们已经证实，由IL-4和IL-9诱导的鼠类动物肥大细胞的增殖和活化取决于JAK3-和yc信号传导[铃木(Suzuki)等人,血液学(Blood)96:2172-2180(2000)]。
敏化肥大细胞的高亲和力免疫球蛋白(Ig)E受体交联引起促炎性介体(包括多种血管活性细胞因子)的释放，导致急性过敏反应或速发型(I型)超敏反应[哥顿(Gordon)等人,自然(Nature)346:274-276(1990)；和盖利N.(Galli,N.)英格兰医学杂志(Engl.J.Med.),328:257-265(1993)]。已经在活体外和活体内确定了JAK3于IgE受体介导的肥大细胞反应中所起的关键作用[马拉维雅(Malaviya)等人,生物化学与生物物理学研究通讯(Biochem.Biophys.Res.Commun.)257:807-813(1999)]。此外，也已报导通过抑制JAK3，可预防由肥大细胞活化所介导的I型超敏反应，包括过敏性反应[马拉维雅(Malaviya)等人,生物化学杂志(J.Biol.Chem.)274:27028-27038(1999)]。利用JAK3抑制剂靶向肥大细胞在活体外将调节肥大细胞的失调，而且在活体内将预防IgE受体/抗原介导的过敏性反应。
最近的一项研究描述靶向JAK3可成功用于免疫抑制和同种异体移植物接受。这项研究表明，在投予JAK3抑制剂后，布法罗(buffalo)心脏同种异体移植物在维斯塔尔佛司(Wistar Furth)接受者体内的存活具剂量依赖性，表明可能调节移植物抗宿主疾病中的不当免疫反应[克肯(Kirken),移植学会会报(Transpl.Proc.)33:3268-3270(2001)]。
所牵涉的IL-4介导的STAT磷酸化是作为早期和晚期类风湿性关节炎(RA)中所涉及的机制。RA滑膜和滑液中促炎性细胞因子的上调是RA的一个特征。据证实，IL-4介导的IL-4/STAT路径活化是由詹纳斯氏激酶(JAK 1和JAK 3)所介导，而且在RA滑膜中有IL-4相关性JAK激酶表达[穆勒-拉德纳(Muller-Ladner)等人,免疫学杂志(J.Immunol.)164:3894-3901(2000)]。
家族性肌萎缩性侧索硬化症(FALS)是一种致死性神经退化性病症，影响了约10％的ALS患者。在用JAK3特异性抑制剂治疗后，FALS小鼠的存活率有所增加。这证实了JAK3在FALS中起作用[特瑞尔(Trieu)等人,生物化学与生物物理学研究通讯(Biochem.Biophys.Res.Commun.)267:22-25(2000)]。
信号转导因子和转录活化因子(STAT)蛋白主要由JAK家族激酶活化。由最近的一项研究得到的结果表明，利用特异性抑制剂靶向JAK家族激酶有可能干预JAK/STAT信号传导路径，从而能用于治疗白血病[萨德拜克(Sudbeck)等人,临床癌症研究(Clin.CancerRes.)5:1569-1582(1999)]。JAK3特异性化合物显示可抑制表达JAK3的细胞系DAUDI、RAMOS、LC1；19、NALM-6、MOLT-3和HL-60的克隆生长。抑制JAK3和TYK 2将消除STAT3的酪氨酸磷酸化，并抑制蕈样肉芽肿病(皮肤T细胞淋巴瘤的一种形式)的细胞生长。
JAK3也已牵涉到糖尿病中。JAK3抑制剂在NOD小鼠自体免疫性1型糖尿病模型中展现有效的免疫调节活性并延迟糖尿病发作(赛特科维克-科维杰(Cetkovic-Cvrlje)等人,临床免疫学(Clin.Immunol.)106:213-225(2003))。
根据另一实施例，本发明提供一种治疗患者的JAK3介导的疾病或病状或者减轻其严重程度的方法，其包含对所述患者投予本发明组合物的步骤。
本文使用的术语“JAK3介导的疾病”是指已知JAK3激酶在其中起作用的任何疾病或其它有害病状。因此，本发明另一实施例涉及治疗已知JAK3激酶在其中起作用的一种或一种以上疾病，或减轻所述疾病的严重程度。具体地说，本发明涉及一种治疗选自例如以下的疾病或病状或者减轻其严重程度的方法：免疫反应，例如过敏性或I型超敏反应；哮喘；自体免疫性疾病，例如移植物排斥反应、移植物抗宿主疾病、类风湿性关节炎、糖尿病(例如I型糖尿病)、肌萎缩性侧索硬化症和多发性硬化症；神经退化性病症，例如家族性肌萎缩性侧索硬化症(FALS)；以及实体和血液恶性疾病，例如白血病和淋巴瘤，其中所述方法包含对有需要的患者投予本发明组合物。
根据本发明的方法，可使用有效治疗癌症、自体免疫性病症、神经退化性或神经病症、精神分裂症、骨相关病症、肝病或心脏病症或者减轻其严重程度的任何投药量和任何投药途径来投予化合物和组合物。所需的确切量将视个体的种类、年龄和一般情况、感染的严重程度、特定药剂、其投药模式等随个体而变化。为便利投药和剂量均一，优选将本发明的化合物调配成单位剂型。本文使用的表述“单位剂型”是指适于欲治疗的患者的药剂的物理离散单元。然而，应了解，本发明化合物和组合物的总每日剂量将由主治医师在合理医学判断的范围内确定。任何特定患者或生物体的特定有效剂量量将视多种因素而定，包括所治疗的病症和所述病症的严重程度；所用特定化合物的活性；所用特定组合物；患者的年龄、体重、一般健康状况、性别和饮食；投药时间；投药途径；和所用特定化合物的排泄速率；治疗的持续时间；与所用特定化合物组合使用或同时使用的药物；和医学领域中众所周知的类似因素。本文使用的术语“患者”是指动物，优选为哺乳动物，且最优选为人类。
视所治疗的感染的严重程度而定，可将本发明的医药学上可接受的组合物经口、直肠、不经肠、脑池内、阴道内、腹膜内、局部(如通过散剂、油膏或滴液)、经颊、以口或鼻喷雾等形式投予人类和其它动物。在某些实施例中，可每天一次或多次，以每天每公斤个体体重约0.01mg到约50mg且优选约1mg到约25mg的剂量量经口或不经肠投予本发明化合物，以获得所需的治疗作用。
供经口投予的液体剂型包括(但不限于)医药学上可接受的乳液、微乳液、溶液、悬浮液、糖浆和酏剂。除活性化合物外，液体剂型还可含有所属领域中常用的惰性稀释剂，例如水或其它溶剂、增溶剂和乳化剂，例如乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苯甲酯、丙二醇、1,3-丁二醇、二甲基甲酰胺、油(尤其棉籽油、花生油、玉米油、胚芽油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油)、甘油、四氢糠醇、聚乙二醇和脱水山梨糖醇的脂肪酸酯，和其混合物。除惰性稀释剂外，口服组合物还可包括佐剂，例如润湿剂、乳化剂和悬浮剂、甜味剂、调味剂和芳香剂。
可根据已知技术使用适当的分散剂或润湿剂和悬浮剂来调配可注射制剂，例如无菌可注射水性或油性悬浮液。无菌可注射制剂也可为于无毒不经肠可接受的稀释剂或溶剂中形成的无菌可注射溶液、悬浮液或乳液，例如1,3-丁二醇溶液。可以使用的可接受的媒剂和溶剂包括水、林格氏溶液、U.S.P.和等渗氯化钠溶液。此外，通常使用无菌不挥发性油作为溶剂或悬浮介质。为此，可以使用包括合成单酸甘油酯或二酸甘油酯在内的任何温和的不挥发性油。另外，也可使用脂肪酸(例如油酸)来制备可注射剂。
举例来说，可通过利用细菌截留过滤器进行过滤，或通过将灭菌剂并入可于使用前溶解或分散于无菌水或其它无菌可注射介质中的无菌固体组合物形式中来将可注射调配物灭菌。
为了延长本发明化合物的作用，通常需要减缓从皮下或肌肉内注射的化合物的吸收。这可以使用具有弱水溶性的结晶或非晶形物质的液体悬浮液来实现。化合物的吸收速率则视其溶解速率而定，而其溶解速率又可视晶体尺寸和晶形而定。或者，通过将化合物溶解或悬浮于油性媒剂中来延缓不经肠投予的化合物形式的吸收。通过以生物可降解聚合物(例如聚丙交酯-聚乙交酯)形成化合物的微胶囊基质来制得可注射储积器形式。可视化合物与聚合物的比率和所用特定聚合物的性质来控制化合物释放的速率。其它生物可降解聚合物的实例包括聚(原酸酯)和聚(酸酐)。也可通过将化合物封装于可与身体组织相容的脂质体或微乳液中来制备储积器式可注射调配物。
用于经直肠或阴道投予的组合物优选为栓剂，其可通过将本发明化合物与适合的非刺激性赋形剂或载剂(例如可可脂、聚乙二醇或栓剂蜡)混合来制备，所述赋形剂或载剂在环境温度下为固体，但在体温下为液体，且因此在直肠或阴道腔中熔融并释放出活性化合物。
供经口投予的固体剂型包括胶囊、片剂、丸剂、散剂和颗粒剂。在所述固体剂型中，将活性化合物与至少一种惰性的医药学上可接受的赋形剂或载剂(例如柠檬酸钠或磷酸二钙)和/或以下物质混合：a)填充剂或增量剂，例如淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露糖醇和硅酸；b)粘合剂，例如羧甲基纤维素、海藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖和阿拉伯胶；c)保湿剂，例如甘油；d)崩解剂，例如琼脂、碳酸钙、马铃薯淀粉或木薯淀粉、海藻酸、某些硅酸盐和碳酸钠；e)阻溶剂，例如石蜡；f)吸收加速剂，例如季铵化合物；g)润湿剂，例如鲸蜡醇和单硬脂酸甘油酯；h)吸附剂，例如高岭土和膨润土；和i)润滑剂，例如滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、月桂基硫酸钠；和其混合物。在胶囊、片剂和丸剂的情况下，剂型中也可包含缓冲剂。
使用例如乳糖或奶糖以及高分子量聚乙二醇等赋形剂，也可将类似类型的固体组合物用作软质和硬质填充明胶胶囊中的填充剂。可制备具有包衣和外壳(例如肠衣和医药调配领域中众所周知的其它包衣)的片剂、糖衣锭、胶囊、丸剂和颗粒剂固体剂型。其可任选包含乳浊剂并且也可具有使其只在或优先在肠道的某一部分中任选以延缓方式释放活性成分的组成。可使用的包埋组合物的实例包括聚合物质和蜡。使用诸如乳糖或奶糖以及高分子量聚乙二醇等赋形剂，也可将类似类型的固体组合物用作软质和硬质填充明胶胶囊中的填充剂。
活性化合物也可呈与一种或一种以上上文所述的赋形剂一起微封装的形式。可制备具有包衣和外壳(例如肠衣、释放控制包衣和医药调配领域中众所周知的其它包衣)的片剂、糖衣锭、胶囊、丸剂和颗粒剂固体剂型。在这些固体剂型中，可将活性化合物与至少一种惰性稀释剂(例如蔗糖、乳糖或淀粉等)混合。在正常实施中，这些剂型也可包含除惰性稀释剂外的其它物质，例如，压片润滑剂和其它压片助剂，例如硬脂酸镁和微晶纤维素。在胶囊、片剂和丸剂的情况下，剂型也可包含缓冲剂。其可任选包含乳浊剂并且可具有使其只在或优先在肠道的某一部分中任选以延缓方式释放活性成分的组成。可使用的包埋组合物的实例包括聚合物质和蜡。
供局部或透皮投予本发明化合物的剂型可包括油膏、糊剂、乳膏、洗液、凝胶、散剂、溶液、喷雾剂、吸入剂或贴片。在无菌条件下，将活性组分与医药学上可接受的载剂和(需要时)任何所需的防腐剂或缓冲剂混合。眼用调配物、滴耳液和滴眼液也涵盖在本发明的范围内。此外，本发明涵盖使用透皮贴片，其具有使化合物控制递送到身体的附加优势。可通过将化合物溶解或分散于适当介质中制得所述剂型。也可使用吸收增强剂来增加化合物穿过皮肤的通量。可通过提供速率控制膜或通过将化合物分散于聚合物基质或凝胶中来控制速率。
根据一个实施例，本发明涉及一种抑制生物样品中的蛋白激酶活性的方法，其包含使所述生物样品与本发明化合物或包含所述化合物的组合物接触的步骤。
根据另一实施例，本发明涉及一种抑制生物样品中的ErbB1、ErbB2、ErbB3、ErbB4、TEC激酶和/或JAK3或其突变体的活性的方法，其包含使所述生物样品与本发明化合物或包含所述化合物的组合物接触的步骤。在某些实施例中，本发明涉及一种不可逆抑制生物样品中的ErbB1、ErbB2、ErbB3、ErbB4、TEC激酶和/或JAK3或其突变体的活性的方法，其包含使所述生物样品与本发明化合物或包含所述化合物的组合物接触的步骤。
本文使用的术语“生物样品”包括(但不限于)细胞培养物或其提取物；从哺乳动物获得的活组织检查材料或其提取物；和血液、唾液、尿液、粪便、精液、泪液或其它体液，或其提取物。
抑制生物样品中的蛋白激酶或一种选自ErbB1、ErbB2、ErbB3、ErbB4、TEC激酶和/或JAK3或其突变体的蛋白激酶的活性，将适用于所属领域的技术人员已知的多个目的。所述目的的实例包括(但不限于)输血、器官移植、生物试样储存和生物分析。
本发明另一实施例涉及一种抑制患者体内的蛋白激酶活性的方法，其包含对所述患者投予本发明化合物或包含所述化合物的组合物的步骤。
根据另一实施例，本发明涉及一种抑制患者体内ErbB1、ErbB2、ErbB3、ErbB4、TEC激酶和/或JAK3中一者或多者或者其突变体的活性的方法，其包含对所述患者投予本发明化合物或包含所述化合物的组合物的步骤。根据某些实施例，本发明涉及一种不可逆抑制患者体内ErbB1、ErbB2、ErbB3、ErbB4、TEC激酶和/或JAK3中一者或多者或者其突变体的活性的方法，其包含对所述患者投予本发明化合物或包含所述化合物的组合物的步骤。在其它实施例中，本发明提供一种治疗有需要的患者的由ErbB1、ErbB2、ErbB3、ErbB4、TEC激酶和/或JAK3中一者或多者或者其突变体介导的病症的方法，其包含对所述患者投予本发明化合物或其医药学上可接受的组合物的步骤。所述病症已于本文中详细描述。
视欲治疗的特定病状、病症或疾病而定，在本发明组合物中也可存在其它常投予用于治疗所述病状的治疗剂。如本文所使用，常投予用于治疗特定疾病或病状的其它治疗剂称为“适于所治疗的疾病或病状”。
举例来说，将本发明化合物或其医药学上可接受的组合物与化疗剂组合投予，以治疗增生性疾病和癌症。已知化疗剂的实例包括(但不限于)阿霉素(Adriamycin)、地塞米松(dexamethasone)、长春新碱(vincristine)、环磷酰胺(cyclophosphamide)、氟尿嘧啶(fluorouracil)、拓扑替康(topotecan)、紫杉酚(taxol)、干扰素、铂衍生物、紫杉烷(taxane)(例如太平洋紫杉醇(paclitaxel))、长春生物碱(vinca alkaloid)(例如长春花碱(vinblastine))、蒽环霉素(anthracycline)(例如多柔比星(doxorubicin))、表鬼臼毒素(epipodophyllotoxin)(例如依托泊苷(etoposide))、顺铂(cisplatin)、mTOR抑制剂(例如雷帕霉素(rapamycin))、甲氨喋呤(methotrexate)、放线菌素D(actinomycin D)、海兔毒素10(dolastatin 10)、秋水仙碱(colchicine)、依米丁(emetine)、三甲曲沙(trimetrexate)、氯苯氨啶(metoprine)、环孢素(cyclosporine)、道诺霉素(daunorubicin)、替尼泊苷(teniposide)、两性霉素(amphotericin)、烷化剂(例如苯丁酸氮芥(chlorambucil))、5-氟尿嘧啶、喜树碱(campthothecin)、顺铂、甲硝唑(metronidazole)和GleevecTM等。在其它实施例中，将本发明化合物与如阿瓦斯丁(Avastin)或维克替比等生物剂组合投予。
在某些实施例中，将本发明化合物或其医药学上可接受的组合物与选自以下任一者或多者的抗增生剂或化疗剂组合投予：阿巴瑞克(abarelix)、阿地白介素(aldesleukin)、阿仑单抗(alemtuzumab)、阿里维A酸(alitretinoin)、别嘌醇(allopurinol)、六甲密胺(altretamine)、氨磷汀(amifostine)、阿那曲唑(anastrozole)、三氧化二砷、天冬酰胺酶、阿扎胞苷(azacitidine)、BCG活菌、贝伐单抗(bevacuzimab)、氟尿嘧啶、蓓萨罗丁(bexarotene)、博来霉素(bleomycin)、硼替佐米(bortezomib)、白消安(busulfan)、卡鲁睾酮(calusterone)、卡培他滨(capecitabine)、喜树碱、卡铂(carboplatin)、卡莫司汀(carmustine)、塞来昔布(celecoxib)、西妥昔单抗、苯丁酸氮芥、克拉屈滨(cladribine)、氯法拉滨(clofarabine)、环磷酰胺、阿糖胞苷(cytarabine)、更生霉素(dactinomycin)、阿法达贝泊汀(darbepoetin alfa)、道诺霉素、地尼白介素(denileukin)、右雷佐生(dexrazoxane)、多烯紫杉醇(docetaxel)、多柔比星(中性)、盐酸多柔比星、丙酸屈他雄酮(dromostanolone propionate)、表柔比星(epirubicin)、阿法依伯汀(epoetin alfa)、尔洛替尼(erlotinib)、雌莫司汀(estramustine)、磷酸依托泊苷、依托泊苷、依西美坦(exemestane)、非格司亭(filgrastim)、氟尿苷氟达拉滨(floxuridinefludarabine)、氟维司群(fulvestrant)、吉非替尼、吉西他宾(gemcitabine)、吉妥单抗(gemtuzumab)、乙酸戈舍瑞林(goserelin acetate)、乙酸组胺瑞林(histrelin acetate)、羟基脲、替伊莫单抗(ibritumomab)、伊达比星(idarubicin)、异环磷酰胺(ifosfamide)、甲磺酸伊马替尼(imatinib mesylate)、干扰素α-2a、干扰素α-2b、伊立替康(irinotecan)、来那度胺(lenalidomide)、雷曲唑(letrozole)、亚叶酸(leucovorin)、乙酸亮丙瑞林(leuprolide acetate)、左旋咪唑(levamisole)、洛莫司汀(lomustine)、乙酸甲地孕酮(megestrol acetate)、美法仑(melphalan)、巯基嘌呤、6-MP、美司钠(mesna)、甲氨喋呤、甲氧沙林(methoxsalen)、丝裂霉素C(mitomycin C)、米托坦(mitotane)、米托蒽醌(mitoxantrone)、诺龙(nandrolone)、奈拉滨(nelarabine)、诺非单抗(nofetumomab)、奥培夫金(oprelvekin)、奥沙利铂(oxaliplatin)、太平洋紫杉醇、帕立非明(palifermin)、帕米膦酸盐(pamidronate)、培加酶(pegademase)、培门冬酶(pegaspargase)、培非司亭(pegfilgrastim)、培美曲塞二钠(pemetrexed disodium)、喷司他丁(pentostatin)、哌泊溴烷(pipobroman)、普卡霉素(plicamycin)、卟吩姆钠(porfimer sodium)、丙卡巴肼(procarbazine)、奎纳克林(quinacrine)、拉布立酶(rasburicase)、利妥昔单抗(rituximab)、沙格司亭(sargramostim)、索拉非尼(sorafenib)、链佐星(streptozocin)、马来酸舒尼替尼(sunitinib maleate)、滑石、他莫昔芬(tamoxifen)、替莫唑胺(temozolomide)、替尼泊苷、VM-26、睾内酯、硫鸟嘌呤、6-TG、塞替派(thiotepa)、拓扑替康、托瑞米芬(toremifene)、托西莫单抗(tositumomab)、曲妥珠单抗、维甲酸(tretinoin)、ATRA、尿嘧啶氮芥(uracil mustard)、伐柔比星(valrubicin)、长春花碱、长春新碱、长春瑞宾(vinorelbine)、唑来膦酸盐或唑来膦酸。
也可与本发明抑制剂组合的药剂的其它实例包括(但不限于)：阿尔茨海默氏病治疗剂，例如盐酸多奈哌齐(donepezil hydrochloride)和利凡斯的明(rivastigmine)帕金森氏病治疗剂，例如L-DOPA/卡比多巴(carbidopa)、恩他卡朋(entacapone)、罗吡尼洛(ropinrole)、普拉克索(pramipexole)、溴麦角环肽(bromocriptine)、培高利特(pergolide)、苯海索(trihexephendyl)和金刚烷胺(amantadine)；用于治疗多发性硬化症(MS)的药剂，例如β干扰素(例如和)、乙酸格拉替雷(glatiramer acetate)和米托蒽醌；哮喘治疗剂，例如沙丁胺醇(albuterol)和孟鲁司特(montelukast)用于治疗精神分裂症的药剂，例如泽普拉(zyprexa)、利瑞司哌(risperdal)、思瑞康(seroquel)和氟哌啶醇(haloperidol)；消炎剂，例如皮质类固醇、TNF阻断剂、IL-1RA、硫唑嘌呤、环磷酰胺和柳氮磺吡啶(sulfasalazine)；免疫调节剂和免疫抑制剂，例如环孢素、他克莫司(tacrolimus)、雷帕霉素、霉酚酸吗啉乙酯(mycophenolate mofetil)、干扰素、皮质类固醇、环磷酰胺、硫唑嘌呤和柳氮磺吡啶；神经营养因子，例如乙酰胆碱酯酶抑制剂、MAO抑制剂、干扰素、抗惊厥药、离子通道阻断剂、利鲁唑(riluzole)和抗帕金森氏病剂；用于治疗心血管疾病的药剂，例如β阻断剂、ACE抑制剂、利尿剂、硝酸盐、钙通道阻断剂和他汀类(statin)；用于治疗肝病的药剂，例如皮质类固醇、消胆胺(cholestyramine)、干扰素和抗病毒剂；用于治疗血液病症的药剂，例如皮质类固醇、抗白血病剂和生长因子；以及用于治疗免疫缺陷病症的药剂，例如γ球蛋白。
在某些实施例中，将本发明化合物或其医药学上可接受的组合物与单克隆抗体或siRNA治疗剂组合投予。
所述其它药剂可作为多剂量方案的一部分与含本发明化合物的组合物分开投予。或者，这些药剂可作为单一剂型的一部分，与本发明化合物一起混合于单一组合物中。如果作为多剂量方案的一部分投予，那么两种活性剂可同时、依次或彼此隔开一段时间内(通常彼此隔开5小时)提供。
本文使用的术语“组合”、“组合的”和相关术语是指同时或依次投予本发明的治疗剂。举例来说，本发明化合物可与另一治疗剂同时投予，或以单独单位剂型依次投予，或一起于单一单位剂型中投予。因此，本发明提供一种单位剂型，其包含所提供的化合物、另一治疗剂和医药学上可接受的载剂、佐剂或媒剂。
可与载剂物质组合产生单一剂型的本发明化合物与另一治疗剂(于包含上述另一治疗剂的那些组合物中)的量将视所治疗的宿主和特定投药模式而变化。优选应将本发明组合物调配成可投予每天每公斤体重介于0.01到100mg之间剂量的本发明化合物。
在包含另一治疗剂的组合物中，所述另一治疗剂与本发明化合物可协同作用。因此，所述组合物中另一治疗剂的量将低于只利用所述治疗剂的单一疗法所需的量。利用所述组合物，可投予每天每公斤体重介于0.01到1,000μg之间剂量的所述另一治疗剂。
本发明组合物中存在的另一治疗剂的量将不超过以包含所述治疗剂作为唯一活性剂的组合物通常投予的量。本文揭示的组合物中另一治疗剂的量优选在包含所述药剂作为唯一治疗活性剂的组合物中通常所存在的量的约50％到100％的范围内。
还可将本发明化合物或其医药学上可接受的组合物并入用于涂布植入式医疗装置(例如假体、人工瓣膜、血管移植物、支架和导管)的组合物中。举例来说，人们已经使用血管支架来克服再狭窄(损伤后血管壁再变窄)。然而，使用支架或其它植入式装置的患者有形成凝块或血小板活化的风险。可通过用包含激酶抑制剂的医药学上可接受的组合物预先涂布装置来防止或减少这些不当作用。涂有本发明化合物的植入式装置是本发明的另一实施例。
5.探针化合物
在某些方面中，可将本发明化合物系栓于可检测部分以形成探针化合物。一方面，本发明的探针化合物包含本文所述的式I-a或I-b的不可逆蛋白激酶抑制剂、可检测部分，以及将所述抑制剂连接于所述可检测部分的系栓部分(tethering moiety)。
在一些实施例中，本发明的这些探针化合物包含所提供的式I-a或I-b化合物借助二价系栓部分-T-系栓于可检测部分Rt。系栓部分可经由环A、环B或R1连接于式I-a或I-b化合物。所属领域的一般技术人员将了解，当将系栓部分连接于R1时，R1为二价弹头基团，称为R1'。在某些实施例中，所提供的探针化合物选自式V-a、V-b、VI-a、VI-b、VII-a或VII-b中任一者：
其中环A、环B、R1、m、p、Rx、Ry、Rv、W1和W2各自如上文关于式I-a和I-b所定义，且如本文中的类别和亚类中所描述，R1'为二价弹头基团，T为二价系栓部分；且Rt为可检测部分。
在一些实施例中，Rt为选自一次标记或二次标记的可检测部分。在某些实施例中，Rt为选自荧光标记(例如荧光染料或荧光团)、质量标签、化学发光基团、发色团、电子致密基团或能量转移剂的可检测部分。
本文使用的术语“可检测部分”与术语“标记”和“报导体”可互换使用，而且指能够进行检测的任何部分，例如一次标记和二次标记。可使用定量(绝对、近似或相对地)所研究系统中的可检测部分的方法来测量可检测部分的存在。在一些实施例中，所述方法是所属领域的一般技术人员众所周知的，并且包括定量报导体部分(例如标记、染料、光交联剂、细胞毒性化合物、药物、亲和标记、光亲和标记、反应性化合物、抗体或抗体片段、生物材料、纳米粒子、自旋标记、荧光团、含金属部分、放射性部分、量子点、新颖官能团、与其它分子共价或非共价相互作用的基团、光隔离部分(photocaged moiety)、光化辐射可激发部分、配体、可光异构化部分、生物素、生物素类似物(例如生物素亚砜)、并有重原子的部分、可化学裂解的基团、可光裂解的基团、氧化还原活性剂、同位素标记的部分、生物物理学探针、磷光基团、化学发光基团、电子致密基团、磁性基团、嵌入基团、发色团、能量转移剂、生物活性剂、可检测标记和上述的任何组合)的任何方法。
一次标记(例如放射性同位素(例如氚、32P、33P、35S、14C、123I、124I、125I或131I))、质量标签(包括(但不限于)稳定同位素(例如13C、2H、17O、18O、15N、19F和127I))、正电子发射同位素(例如11C、18F、13N、124I和15O)和荧光标记是产生信号的报导基团，其可在无进一步修饰下进行检测。可检测部分可通过包括(但不限于)以下在内的方法来进行分析：荧光、正电子发射断层摄影法、SPECT医学成像、化学发光、电子自旋共振、紫外/可见光吸收光谱分析、质谱分析、核磁共振、磁共振、流式细胞测量术、自动放射照相术、闪烁计数、磷成像和电化学方法。
本文使用的术语“二次标记”是指需要存在能产生可检测信号的第二中间物的部分，例如生物素和各种蛋白质抗原。对于生物素，二次中间物可包括抗生蛋白链菌素-酶结合物。对于抗原标记，二次中间物可包括抗体-酶结合物。一些荧光基团可充当二次标记，因为其在非辐射性荧光共振能量转移(FRET)的过程中将能量转移到另一基团，而且第二基团会产生所检测的信号。
本文使用的术语“荧光标记”、“荧光染料”和“荧光团”是指吸收某一指定激发波长的光能并发射一种不同波长的光能的部分。荧光标记的实例包括(但不限于)：Alexa Fluor系列染料(Alexa Fluor 350、Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 532、Alexa Fluor 546、Alexa Fluor 568、Alexa Fluor 594、Alexa Fluor 633、Alexa Fluor 660和Alexa Fluor680)、AMCA、AMCA-S、BODIPY系列染料(BODIPY FL、BODIPY R6G、BODIPY TMR、BODIPY TR、BODIPY 493/503、BODIPY 530/550、BODIPY 558/568、BODIPY 564/570、BODIPY 576/589、BODIPY 581/591、BODIPY 630/650、BODIPY 650/665)、羧基罗丹明6G(Carboxyrhodamine6G)、羧基-X-罗丹明(ROX)、瀑布蓝(Cascade Blue)、瀑布黄(Cascade Yellow)、香豆素343(Coumarin 343)、花青染料(Cyanine dye)(Cy3、Cy5、Cy3.5、Cy5.5)、丹酰(Dansyl)、达坡(Dapoxyl)、二烷基氨基香豆素、4',5'-二氯-2',7'-二甲氧基-荧光素、DM-NERF、伊红(Eosin)、藻红(Erythrosin)、荧光素、FAM、羟基香豆素、IRDye(IRD40、IRD 700、IRD 800)、JOE、丽丝胺罗丹明B(Lissamine rhodamine B)、马里那蓝(Marina Blue)、甲氧基香豆素、萘并荧光素(Naphthofluorescein)、俄勒冈绿488(Oregon Green 488)、俄勒冈绿500、俄勒冈绿514、太平洋蓝(Pacific Blue)、PyMPO、芘、罗丹明B、罗丹明6G、罗丹明绿、罗丹明红、对甲氨基酚绿(Rhodol Green)、2',4',5',7'-四溴砜-荧光素、四甲基-罗丹明(TMR)、羧基四甲基罗丹明(TAMRA)、得克萨斯红(Texas Red)、得克萨斯红-X、5(6)-羧基荧光素、2,7-二氯荧光素、N,N-双(2,4,6-三甲基苯基)-3,4:9,10-苝双(二甲酰亚胺、HPTS、乙基伊红、DY-490XL MegaStokes、DY-485XL MegaStokes、阿第伦达克绿520(Adirondack Green 520)、ATTO 465、ATTO 488、ATTO 495、YOYO-1,5-FAM、BCECF、二氯荧光素、罗丹明110、罗丹明123、YO-PRO-1、SYTOX绿、钠绿、SYBR绿I、Alexa Fluor 500、FITC、Fluo-3、Fluo-4、荧光-祖母绿(fluoro-emerald)、YoYo-1ssDNA、YoYo-1dsDNA、YoYo-1、SYTO RNASelect、Diversa绿-FP、龙绿(Dragon Green)、EvaGreen、冲浪绿EX(Surf Green EX)、光谱绿(Spectrum Green)、NeuroTrace 500525、NBD-X、MitoTracker绿FM、LysoTracker绿DND-26、CBQCA、PA-GFP(活化后)、WEGFP(活化后)、FlASH-CCXXCC、单体阿兹米绿(Azami Green monomeric)、阿兹米绿、绿色荧光蛋白(GFP)、EGFP(坎培尔提森(Campbell Tsien)2003)、EGFP(帕特森(Patterson)2001)、枫绿(Kaede Green)、7-苯甲基氨基-4-硝基苯基-2-氧杂-1,3-二唑、Bexl、多柔比星、荧光绿(Lumio Green)和SuperGlo GFP。
本文使用的术语“质量标签”是指能够使用质谱分析(MS)检测技术根据质量唯一性检测的任何部分。质量标签的实例包括电泳释放标签，例如N-[3-[4'-[(对甲氧基四氟苯甲基)氧基]苯基]-3-甲基甘油基]异哌啶甲酸、4'-[2,3,5,6-四氟-4-(五氟苯氧基)]甲基苯乙酮，和其衍生物。这些质量标签的合成和效用描述于美国专利4,650,750、4,709,016、5,360,8191、5,516,931、5,602,273、5,604,104、5,610,020和5,650,270中。质量标签的其它实例包括(但不限于)核苷酸、双脱氧核苷酸、具有不同长度和碱基组成的寡核苷酸、寡肽、寡糖，以及具有不同长度和单体组成的其它合成聚合物。具有适当质量范围(100到2000道尔顿(Dalton))的多种中性与带电有机分子(生物分子或合成化合物)也可用作质量标签。稳定同位素(例如13C、2H、17O、18O和15N)也可用作质量标签。
本文使用的术语“化学发光基团”是指在不加热情况下因发生化学反应而发光的基团。举例来说，鲁米诺(luminol)(5-氨基-2,3-二氢-1,4-酞嗪二酮)与如过氧化氢(H2O2)等氧化剂在碱和金属催化剂存在下反应，产生激发态产物(3-氨基邻苯二甲酸酯，3-APA)。
本文使用的术语“发色团”是指吸收可见波长、紫外(UV)波长或红外(IR)波长的光的分子。
本文使用的术语“染料”是指含有发色团的可溶性着色物质。
本文使用的术语“电子致密基团”是指当用电子束照射时会散射电子的基团。所述基团包括(但不限于)钼酸铵、碱式硝酸铋、碘化镉、碳酰肼、六水合氯化铁、六亚甲基四胺、无水三氯化铟、硝酸镧、三水合乙酸铅、三水合柠檬酸铅、硝酸铅、高碘酸、磷钼酸、磷钨酸、铁氰化钾、亚铁氰化钾、钌红、硝酸银、“浓”蛋白银(silver proteinate)(Ag分析：8.0-8.5％)、四苯基卟吩银(S-TPPS)、氯金酸钠、钨酸钠、硝酸铊、氨基硫脲(TSC)、乙酸铀酰、硝酸铀酰和硫酸氧钒。
本文使用的术语“能量转移剂”是指可贡献能量或从另一分子接受能量的分子。仅举例来说，荧光共振能量转移(FRET)为偶极-偶极偶合过程，通过所述过程，荧光供体分子的激发态能量非辐射性地转移到未激发的受体分子，随后所述受体分子以荧光形式发射较长波长的贡献能量。
本文使用的术语“并有重原子的部分”是指并有通常比碳重的原子的离子的基团。在一些实施例中，所述离子或原子包括(但不限于)硅、钨、金、铅和铀。
本文使用的术语“光亲和标记”是指具有当曝露于光时会与标记具有亲和性的分子形成键联的基团的标记。
本文使用的术语“光隔离部分”是指当在某些波长下光照时共价或非共价结合其它离子或分子的基团。
本文使用的术语“可光异构化部分”是指当光照时由一种异构形式变为另一种异构形式的基团。
本文使用的术语“放射性部分”是指核自发地放出核辐射(例如，α、β或γ粒子)的基团；其中α粒子为氦核，β粒子为电子，且γ粒子为高能量光子。
本文使用的术语“自旋标记”是指含有显示不成对电子自旋的原子或一组原子的分子(即，稳定的顺磁性基团)，在一些实施例中，这些分子是借助电子自旋共振谱分析来进行检测，而在其它实施例中其连接到另一分子。所述自旋标记分子包括(但不限于)硝酰基和氮氧化物，而且在一些实施例中，其为单自旋标记或双自旋标记。
本文使用的术语“量子点”是指胶状半导体纳米晶体，在一些实施例中，其可在近红外线中检测，而且具有极高量子产率(即，在适度光照后非常明亮)。
所属领域的一般技术人员将认识到，可检测部分可经由适合的取代基连接至所提供的化合物。本文使用的术语“适合的取代基”是指能够共价连接至可检测部分的部分。这些部分是所属领域的一般技术人员众所周知的，并且包括含有例如羧酸酯部分、氨基部分、硫醇部分或羟基部分等的基团。应了解，这些部分可直接连接到所提供的化合物，或经由系栓部分(例如二价饱和或不饱和烃链)连接到所提供的化合物。
在一些实施例中，可检测部分是经由点击化学(click chemistry)连接到所提供的化合物。在一些实施例中，所述部分经由叠氮化物与炔烃任选在铜催化剂存在下发生1,3-环加成反应来连接。所属领域中已知使用点击化学的方法，而且其包括罗斯托斯夫(Rostovtsev)等人,应用化学(国际版)(Angew.Chem.Int.Ed.)2002,41,2596-99；和孙(Sun)等人,生物共轭化学(Bioconjugate Chem.),2006,17,52-57所述的方法。在一些实施例中，提供预备点击抑制剂部分，并使其与预备点击-T-Rt部分反应。本文使用的“预备点击”是指含有叠氮化物或炔烃以用于点击化学反应的部分。在一些实施例中，预备点击抑制剂部分包含叠氮化物。在某些实施例中，预备点击-T-Rt部分包含用于无铜点击化学反应的应变环辛炔(strained cyclooctyne)(例如使用贝斯肯(Baskin)等人,美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)2007,104,16793-16797中所述的方法)。
在某些实施例中，预备点击抑制剂部分具有以下各式中的一者：
或
其中环A、环B、W1、W2、Ry、Rv、p、Rx和m如上文关于式I所定义且如本文中所描述，并且q为1、2或3。
例示性预备点击抑制剂包括：
和
在一些实施例中，预备点击-T-Rt部分具有下式：
预备点击抑制剂部分与预备点击-T-Rt部分经由[3+2]-环加成进行联接的例示性反应如下所示：
在一些实施例中，可检测部分Rt选自标记、染料、光交联剂、细胞毒性化合物、药物、亲和标记、光亲和标记、反应性化合物、抗体或抗体片段、生物材料、纳米粒子、自旋标记、荧光团、含金属部分、放射性部分、量子点、新颖官能团、与其它分子共价或非共价相互作用的基团、光隔离部分、光化辐射可激发部分、配体、可光异构化部分、生物素、生物素类似物(例如生物素亚砜)、并有重原子的部分、可化学裂解的基团、可光裂解的基团、氧化还原活性剂、同位素标记的部分、生物物理学探针、磷光基团、化学发光基团、电子致密基团、磁性基团、嵌入基团、发色团、能量转移剂、生物活性剂、可检测标记，或其组合。
在一些实施例中，Rt为生物素或其类似物。在某些实施例中，Rt为生物素。在某些实施例中，Rt为生物素亚砜。
在另一实施例中，Rt为荧光团。在又一实施例中，所述荧光团选自Alexa Fluor系列染料(Alexa Fluor 350、Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 532、Alexa Fluor 546、AlexaFluor 568、Alexa Fluor 594、Alexa Fluor 633、Alexa Fluor 660和Alexa Fluor 680)、AMCA、AMCA-S、BODIPY系列染料(BODIPY FL、BODIPY R6G、BODIPY TMR、BODIPY TR、BODIPY493/503、BODIPY 530/550、BODIPY 558/568、BODIPY 564/570、BODIPY 576/589、BODIPY581/591、BODIPY 630/650、BODIPY 650/665)、羧基罗丹明6G、羧基-X-罗丹明(ROX)、瀑布蓝、瀑布黄、香豆素343、花青染料(Cy3、Cy5、Cy3.5、Cy5.5)、丹酰、达坡、二烷氨基香豆素、4',5'-二氯-2',7'-二甲氧基-荧光素、DM-NERF、伊红、藻红、荧光素、FAM、羟基香豆素、IRDye(IRD40、IRD 700、IRD 800)、JOE、丽丝胺罗丹明B、马里那蓝、甲氧基香豆素、萘并荧光素、俄勒冈绿488、俄勒冈绿500、俄勒冈绿514、太平洋蓝、PyMPO、芘、罗丹明B、罗丹明6G、罗丹明绿、罗丹明红、对甲氨基酚绿、2',4',5',7'-四溴砜-荧光素、四甲基-罗丹明(TMR)、羧基四甲基罗丹明(TAMRA)、得克萨斯红、得克萨斯红-X、5(6)-羧基荧光素、2,7-二氯荧光素、N,N-双(2,4,6-三甲基苯基)-3,4:9,10-苝双(二甲酰亚胺、HPTS、乙基伊红、DY-490XLMegaStokes、DY-485XL MegaStokes、阿第伦达克绿520、ATTO 465、ATTO 488、ATTO 495、YOYO-1,5-FAM、BCECF、二氯荧光素、罗丹明110、罗丹明123、YO-PRO-1、SYTOX绿、钠绿、SYBR绿I、Alexa Fluor 500、FITC、Fluo-3、Fluo-4、荧光-祖母绿、YoYo-1ssDNA、YoYo-1dsDNA、YoYo-1、SYTO RNASelect、Diversa绿-FP、龙绿、EvaGreen、冲浪绿EX、光谱绿、NeuroTrace500525、NBD-X、MitoTracker绿FM、LysoTracker绿DND-26、CBQCA、PA-GFP(活化后)、WEGFP(活化后)、FlASH-CCXXCC、单体阿兹米绿、阿兹米绿、绿色荧光蛋白(GFP)、EGFP(坎培尔提森,2003)、EGFP(帕特森,2001)、枫绿、7-苯甲氨基-4-硝基苯基-2-氧杂-1,3-二唑、Bexl、多柔比星、荧光绿或SuperGlo GFP。
如上文大体上所描述，所提供的探针化合物包含系栓部分-T-，其将不可逆抑制剂连接于可检测部分。本文使用的术语“系栓剂”或“系栓部分”是指任何二价化学间隔基，包括(但不限于)共价键、聚合物、水溶性聚合物、任选经取代的烷基、任选经取代的杂烷基、任选经取代的杂环烷基、任选经取代的环烷基、任选经取代的杂环基、任选经取代的杂环烷基烷基、任选经取代的杂环烷基烯基、任选经取代的芳基、任选经取代的杂芳基、任选经取代的杂环烷基烯基烷基、任选经取代的酰胺部分、醚部分、酮部分、酯部分、任选经取代的氨基甲酸酯部分、任选经取代的腙部分、任选经取代的肼部分、任选经取代的肟部分、二硫化物部分、任选经取代的亚胺部分、任选经取代的磺酰胺部分、砜部分、亚砜部分、硫醚部分或其任何组合。
在一些实施例中，系栓部分-T-选自共价键、聚合物、水溶性聚合物、任选经取代的烷基、任选经取代的杂烷基、任选经取代的杂环烷基、任选经取代的环烷基、任选经取代的杂环烷基烷基、任选经取代的杂环烷基烯基、任选经取代的芳基、任选经取代的杂芳基和任选经取代的杂环烷基烯基烷基。在一些实施例中，系栓部分为任选经取代的杂环。在其它实施例中，杂环选自氮丙啶、环氧乙烷、环硫化物、氮杂环丁烷、氧杂环丁烷、吡咯啉、四氢呋喃、四氢噻吩、吡咯烷、吡唑、吡咯、咪唑、三唑、四唑、噁唑、异噁唑、环氧乙烯、噻唑、异噻唑、二硫杂环戊烷、呋喃、噻吩、哌啶、四氢吡喃、硫杂环己烷(thiane)、吡啶、吡喃、噻喃、哒嗪、嘧啶、吡嗪、哌嗪、噁嗪、噻嗪、二硫杂环己烷和二噁烷。在一些实施例中，杂环为哌嗪。在其它实施例中，系栓部分任选经卤素、-CN、-OH、-NO2、烷基、S(O)和S(O)2取代。在其它实施例中，水溶性聚合物是PEG基团。
在其它实施例中，系栓部分使可检测部分与激酶抑制剂部分之间在空间上充分隔开。在其它实施例中，系栓部分是稳定的。在另一实施例中，系栓部分实质上不影响可检测部分的反应。在其它实施例中，系栓部分使探针化合物在化学上稳定。在其它实施例中，系栓部分使探针化合物具有足够溶解性。
在一些实施例中，系栓部分-T-(例如水溶性聚合物)在一端与所提供的不可逆抑制剂偶合，并在另一端与可检测部分Rt偶合。在其它实施例中，水溶性聚合物是经由所提供的不可逆抑制剂的官能团或取代基偶合。在其它实施例中，水溶性聚合物经由报导部分的官能团或取代基偶合。
在一些实施例中，用于系栓部分-T-中的亲水性聚合物的实例包括(但不限于)：聚烷基醚和其经烷氧基封端的类似物(例如，聚氧乙二醇、聚氧乙二醇/丙二醇和其经甲氧基或乙氧基封端的类似物，聚氧乙二醇，后者也称为聚乙二醇或PEG)；聚乙烯吡咯烷酮；聚乙烯烷基醚；聚噁唑啉、聚烷基噁唑啉和聚羟基烷基噁唑啉；聚丙烯酰胺、聚烷基丙烯酰胺和聚羟烷基丙烯酰胺(例如，聚羟丙基甲基丙烯酰胺和其衍生物)；聚丙烯酸羟烷基酯；聚唾液酸和其类似物；亲水性肽序列；多糖和其衍生物，包括葡聚糖和葡聚糖衍生物，例如羧甲基葡聚糖、硫酸葡聚糖、氨基葡聚糖；纤维素和其衍生物，例如羧甲基纤维素、羟烷基纤维素；几丁质和其衍生物，例如壳聚糖、琥珀酰基壳聚糖、羧甲基几丁质、羧甲基壳聚糖；透明质酸和其衍生物；淀粉；海藻酸盐；硫酸软骨素；白蛋白；普鲁兰多糖(pullulan)和羧甲基普鲁兰多糖；聚氨基酸和其衍生物，例如聚谷氨酸、聚赖氨酸、聚天冬氨酸、聚天冬酰胺；马来酸酐共聚物，例如苯乙烯马来酸酐共聚物、二乙烯基乙基醚马来酸酐共聚物；聚乙烯醇；其共聚物；其三元共聚物；其混合物；和上述物质的衍生物。在其它实施例中，水溶性聚合物可为任何结构形式，包括(但不限于)线性、叉状或分支形式。在其它实施例中，多官能聚合物衍生物包括(但不限于)具有两个末端的线性聚合物，各末端键结至相同或不同的官能团。
在一些实施例中，水溶性聚合物包含聚(乙二醇)部分。在其它实施例中，聚合物的分子量具有宽广的范围，包括(但不限于)介于约100Da与约100,000Da之间或100,000Da以上。在其它实施例中，聚合物的分子量介于约100Da与约100,000Da之间，包括(但不限于)约100,000Da、约95,000Da、约90,000Da、约85,000Da、约80,000Da、约75,000Da、约70,000Da、约65,000Da、约60,000Da、约55,000Da、约50,000Da、约45,000Da、约40,000Da、约35,000Da、30,000Da、约25,000Da、约20,000Da、约15,000Da、约10,000Da、约9,000Da、约8,000Da、约7,000Da、约6,000Da、约5,000Da、约4,000Da、约3,000Da、约2,000Da、约1,000Da、约900Da、约800Da、约700Da、约600Da、约500Da、约400Da、约300Da、约200Da和约100Da。在一些实施例中，聚合物的分子量介于约100Da与50,000Da之间。在一些实施例中，聚合物的分子量介于约100Da与40,000Da之间。在一些实施例中，聚合物的分子量介于约1,000Da与40,000Da之间。在一些实施例中，聚合物的分子量介于约5,000Da与40,000Da之间。在一些实施例中，聚合物的分子量介于约10,000Da与40,000Da之间。在一些实施例中，聚(乙二醇)分子为分支聚合物。在其它实施例中，支链PEG的分子量介于约1,000Da与约100,000Da之间，包括(但不限于)约100,000Da、约95,000Da、约90,000Da、约85,000Da、约80,000Da、约75,000Da、约70,000Da、约65,000Da、约60,000Da、约55,000Da、约50,000Da、约45,000Da、约40,000Da、约35,000Da、约30,000Da、约25,000Da、约20,000Da、约15,000Da、约10,000Da、约9,000Da、约8,000Da、约7,000Da、约6,000Da、约5,000Da、约4,000Da、约3,000Da、约2,000Da和约1,000Da。在一些实施例中，支链PEG的分子量介于约1,000Da与约50,000Da之间。在一些实施例中，支链PEG的分子量介于约1,000Da与约40,000Da之间。在一些实施例中，支链PEG的分子量介于约5,000Da与约40,000Da之间。在一些实施例中，支链PEG的分子量介于约5,000Da与约20,000Da之间。实质上水溶性主链的上述清单绝非详尽且仅用于说明，并且在一些实施例中，具有上述质量的所有聚合物材料都适用于本文所述的方法和组合物中。
所属领域的一般技术人员应了解，当-T-Rt经由R1弹头基团连接到式I-a或I-b化合物时，那么所得系栓部分包含R1弹头基团。本文使用的短语“包含弹头基团”是指，由式V-a或V-b的-R1'-T-形成的系栓部分经弹头基团取代，或者具有此种弹头基团并入系栓部分中。例如，由-R1'-T-形成的系栓部分可经-L-Y弹头基团取代，其中所述基团如本文所述。或者，由-R1'-T-形成的系栓部分具有弹头基团并入系栓部分中的适当特征。例如，由-R1'-T-形成的系栓部分可包括一个或一个以上不饱和单元和任选存在的取代基和/或杂原子，其组合时将产生能够共价修饰本发明的蛋白激酶的部分。所述-R1-T-系栓部分将于下文中描述。
在一些实施例中，-R1'-T-系栓部分中的亚甲基单元经二价-L-Y'-部分置换，由此提供式V-a-iii或V-b-iii的化合物：
其中环A、环B、m、p、Rx、Ry、Rv、W1、W2、T、L、Y'和Rt各自如上文所定义且如本文中的类别和亚类中所描述，且Y'是上文定义且在本文的类别和亚类中描述的Y基团的二价形式。
在一些实施例中，-R1'-T-系栓部分中的亚甲基单元经-L(Y)-部分置换，由此提供式V-a-iv或V-b-iv的化合物：
其中环A、环B、m、p、Rx、Ry、Rv、W1、W2、T、L、Y和Rt各自如上文所定义且如本文的类别和亚类中所描述。
在一些实施例中，系栓部分经L-Y部分取代，由此提供式V-a-v或V-b-v的化合物：
其中环A、环B、m、p、Rx、Ry、Rv、W1、W2、T、L、Y和Rt各自如上文所定义且如本文的类别和亚类中所描述。
在某些实施例中，系栓部分-T-具有以下结构中的一种：
在一些实施例中，系栓部分-T-具有以下结构：
在其它实施例中，系栓部分-T-具有以下结构：
在某些其它实施例中，系栓部分-T-具有以下结构：
在其它实施例中，系栓部分-T-具有以下结构：
在一些实施例中，系栓部分-T-具有以下结构：
在一些实施例中，-T-Rt具有以下结构：
在其它实施例中，-T-Rt具有以下结构：
在某些实施例中，-T-Rt具有以下结构：
在一些实施例中，具有式V-a、V-b、VI-a、VI-b、VII-a或VII-b的探针化合物是衍生自表5中的任一化合物。
在某些实施例中，探针化合物具有以下结构中的一种：
应了解，许多-T-Rt试剂都可购得。例如，许多生物素化试剂都可从例如斯默科技公司(Thermo Scientific)获得，具有不同系栓剂长度。这些试剂包括NHS-PEG4-生物素和NHS-PEG12-生物素。
在一些实施例中，类似于上文所例示的结构的探针结构可使用本文所述的预备点击抑制剂部分和预备点击-T-Rt部分来制备。
在一些实施例中，所提供的探针化合物共价修饰蛋白激酶的磷酸化构象。一方面，蛋白激酶的磷酸化构象是所述蛋白激酶的活性或无活性形式。在某些实施例中，蛋白激酶的磷酸化构象是所述激酶的活性形式。在某些实施例中，探针化合物可渗透细胞。
在一些实施例中，本发明提供一种测定患者体内所提供的不可逆抑制剂(即，式I-a或I-b化合物)对蛋白激酶的占用率的方法，其包含提供一种或一种以上从已投予了至少一剂所述不可逆抑制剂化合物的患者获得的组织、细胞类型或其溶解产物，使所述组织、细胞类型或其溶解产物与探针化合物(即，式V-a、V-b、VI-a、VI-b、VII-a或VII-b的化合物)接触以共价修饰所述溶解产物中存在的至少一种蛋白激酶，和测量经所述探针化合物共价修饰的所述蛋白激酶的量，以便相较于所述探针化合物对所述蛋白激酶的占用率，测定所述式I-a或I-b的化合物对所述蛋白激酶的占用率。在某些实施例中，所述方法进一步包含调整所述式I-a或I-b的化合物的剂量以增加对所述蛋白激酶的占用率的步骤。在某些其它实施例中，所述方法进一步包含调整所述式I-a或I-b的化合物的剂量以降低对所述蛋白激酶的占用率的步骤。
本文使用的术语“占用率”或“占用”是指所提供的共价抑制剂化合物对蛋白激酶的修饰程度。所属领域的一般技术人员应了解，需要投予对达成对蛋白激酶的所需有效占用率而言尽可能最低的剂量。
在一些实施例中，欲修饰的蛋白激酶是BTK。在其它实施例中，欲修饰的蛋白激酶是EGFR。在某些实施例中，蛋白激酶是JAK。在某些其它实施例中，蛋白激酶是ErbB1、ErbB2或ErbB4中的一者或多者。在其它实施例中，蛋白激酶是TEC、ITK或BMX。
在一些实施例中，探针化合物包含正测定占用率的不可逆抑制剂。
在一些实施例中，本发明提供一种用于评估所提供的不可逆抑制剂在哺乳动物中的功效的方法，其包含对所述哺乳动物投予所提供的不可逆抑制剂；对从所述哺乳动物分离的组织或细胞或者其溶解产物投予所提供的探针化合物；测量探针化合物的可检测部分的活性，和将可检测部分的活性与标准物相比较。
在其它实施例中，本发明提供一种用于评估所提供的不可逆抑制剂在哺乳动物中的药效学的方法，其包含对所述哺乳动物投予所提供的不可逆抑制剂；对一种或一种以上从所述哺乳动物分离的细胞类型或其溶解产物投予本文提供的探针化合物，和在投予抑制剂后的不同时间点测量探针化合物的可检测部分的活性。
在其它实施例中，本发明提供一种用于在活体外标记蛋白激酶的方法，其包含使所述蛋白激酶与本文所述的探针化合物接触。在一个实施例中，接触步骤包含将蛋白激酶与本文提供的探针化合物一起培育。
在某些实施例中，本发明提供一种用于在活体外标记蛋白激酶的方法，其包含使一种或一种以上表达所述蛋白激酶的细胞或组织或者其溶解产物与本文所述的探针化合物接触。
在某些其它实施例中，本发明提供一种用于检测经标记的蛋白激酶的方法，其包含借助电泳法分离蛋白质，所述蛋白质包含经本文所述的探针化合物标记的蛋白激酶，和借助荧光来检测所述探针化合物。
在一些实施例中，本发明提供一种用于在活体外评估所提供的不可逆抑制剂的药效学的方法，其包含将所提供的不可逆抑制剂与目标蛋白激酶一起培育，将本文提供的探针化合物添加到目标蛋白激酶中，和测定经探针化合物修饰的目标的量。
在某些实施例中，探针化合物是通过结合于亲和素(avidin)、抗生蛋白链菌素(streptavidin)、中性链亲和素(neutravidin)或生物素连接蛋白(captavidin)来进行检测。
在一些实施例中，探针是借助蛋白免疫印迹来进行检测。在其它实施例中，探针是借助ELISA来进行检测。在某些实施例中，探针是借助流式细胞测量术来进行检测。
在其它实施例中，本发明提供一种用不可逆抑制剂探测激酶组(kinome)的方法，其包含将一种或一种以上细胞类型或其溶解产物与生物素化的探针化合物一起培育以产生经生物素部分修饰的蛋白质，消化所述蛋白质，用亲和素或其类似物进行捕捉，和进行多维LC-MS-MS，以鉴别经探针化合物修饰的蛋白激酶和所述激酶的加合位点(adductionsite)。
在某些实施例中，本发明提供一种用于测量细胞中的蛋白质合成的方法，其包含将细胞与目标蛋白质的不可逆抑制剂一起培育，在特定时间点形成细胞的溶解产物，和将所述细胞溶解产物与本发明探针化合物一起培育，以测量在较长时间段内自由蛋白质的出现。
在其它实施例中，本发明提供一种用于确定哺乳动物的给药时程以使目标蛋白激酶的占用率达到最大的方法，其包含分析一种或一种以上从已投予了所提供的式I-a或I-b的不可逆抑制剂的哺乳动物分离的细胞类型或其溶解产物(来源于例如所述哺乳动物的脾细胞、周围B细胞、全血、淋巴结、肠组织或其它组织)，其中所述分析步骤包含使所述一种或一种以上组织、细胞类型或者其溶解产物与所提供的探针化合物接触，和测量经探针化合物共价修饰的蛋白激酶的量。
例证
如下文的实例中所述，在某些例示性实施例中，根据以下一般程序制备化合物。应了解，尽管这些一般方法描述了本发明某些化合物的合成，但以下一般方法和所属领域的一般技术人员已知的其它方法都可用于本文所述的所有化合物以及各所述化合物的亚类和种类。
下文实例中所用的化合物编号对应于下文表5中陈述的化合物编号。
实例1
制备N-(3-(5-甲基-2-(苯基氨基)嘧啶-4-基氨基)苯基)丙烯酰胺I-7
根据下文所述的方案、步骤和中间物制备标题化合物。
A)DIPEA，n-BuOH，120℃，30分钟，MW；B)NMP，200℃，10分钟，MW；C)NMP，0℃-30分钟，室温-30分钟。
步骤1
在120℃下对1(2.0g，0.012mol)、1,3-苯二胺(2.0g，0.018mmol)、DIPEA(2.33g，0.018mol)于n-BuOH(20mL)中的溶液进行微波照射，持续30分钟。随后用水(100mL)淬灭反应混合物，用EtOAc萃取3次，每次100mL。用水(100mL)、盐水(100mL)洗涤合并的EtOAc萃取物，用Na2SO4干燥并在减压下浓缩。借助管柱色谱法(SiO2，60-120目，EtOAc/CHCl3：15/85)进一步纯化得到的残余物，得到深褐色固体状的3(1.3g，45％)。
步骤2
对3(1.0g，4.27mmol)、4(1.5g，16.12mmol)于NMP(10.0mL)中的溶液进行微波照射(200℃，10分钟)。冷却反应混合物，用水(100mL)稀释，并用EtOAc萃取3次，每次100mL。用水(100mL)、盐水(100mL)洗涤合并的乙酸乙酯萃取物，用Na2SO4干燥并在减压下浓缩，得到残余物。借助管柱色谱法(SiO2，CHCl3/MeOH：98/2)进一步纯化粗残余物，得到浅褐色固体状的5(0.5g，40.3％)。
步骤3
在0℃下，向经搅拌的5(200mg，0.68mmol)于NMP(2.0mL)中的溶液中添加丙烯酰氯(248mg，0.2.74mmol)，并在0℃下搅拌反应混合物60分钟。随后，将反应混合物与己烷一起搅拌半小时，接着通过倾析从混合物中去除己烷，并用水(10mL)淬灭残余物。用饱和NaHCO3溶液碱化水溶液，随后用EtOAc萃取3次，每次10mL。用水(10mL)、盐水(10mL)洗涤合并的EtOAc萃取物，用Na2SO4干燥并在减压下浓缩。借助管柱色谱法(SiO2，230-400，MeOH/CHCl3：10/90)进一步纯化得到的残余物，得到褐色固体状的I-7(110mg，46.4％)。1H NMR(DMSO-d6)δppm:2.10(s,3H),5.73(dd,1.88&10.42Hz,1H),6.24(dd,J＝1.88&17Hz,1H),6.44(dd,J＝10.08&16.92Hz,1H),6.78(t,J＝7.36Hz,1H),7.06-7.11(m,2H),7.26(t,J＝8.08Hz,1H),7.38-7.40(bm,2H),7.65(d,J＝8.52Hz,2H),7.88(s,1H),7.92(s,1H),8.37(s,1H),8.91(s,1H),10.09(s,1H)；LCMS:m/e346.8(M+1)。
实例2
制备N-(3-(4-(间甲苯基氨基)嘧啶-2-基氨基)苯基)丙烯酰胺I-1
根据下文所述的方案、步骤和中间物制备标题化合物。
A)DIEA，n-BuOH，110℃，30分钟，微波；B)NMP，200℃，10分钟，微波；C)丙烯酰氯，NMP，0℃-30分钟，室温-30分钟。
步骤1
在110℃下对1(0.5g，3.35mmol)、间甲苯胺(0.36g，3.35mmol)、DIEA(0.65g，5.0mmol)于n-BuOH(2.0mL)中的溶液进行微波照射，持续30分钟。随后在减压下浓缩反应混合物，用水(5mL)淬灭，用EtOAc萃取3次，每次20mL。用水(5mL)、盐水(5mL)洗涤合并的EtOAc萃取物，用Na2SO4干燥并在减压下浓缩。借助管柱色谱法(SiO2，60-120目，CHCl3/MeOH：99/1)进一步纯化得到的残余物，得到黄色固体状的3(0.4g，54.2％)。
步骤2
对3(0.2g，0.91mmol)、4(0.2g，1.8mmol)于NMP(2.0mL)中的溶液进行微波照射(200℃，10分钟)。随后冷却反应混合物，用水(10mL)稀释，并用CH2Cl2萃取3次，每次15mL。用水(5mL)、盐水(5mL)洗涤合并的CH2Cl2萃取物，用Na2SO4干燥并在减压下浓缩，得到残余物。借助管柱色谱法(SiO2，CHCl3/MeOH：98/2)进一步纯化粗残余物，得到浅黄色固体状的5(0.14g，53％)。
步骤3
在0℃下，向经搅拌的5(0.075g，0.25mmol)于NMP(1.0mL)中的溶液中添加丙烯酰氯(0.19g，2.0mmoL)，并在0℃下搅拌反应混合物30分钟，随后在室温下搅拌30分钟。借助管柱色谱法(中性A12O3，CHCl3/MeOH：98/2)纯化净反应混合物，得到白色固体状的I-1(0.04g，45％)。1H NMR(DMSO-d6)δppm:2.56(s,3H),5.71(dd,J＝2.0&10.08Hz,1H),6.20-6.25(m,2H),6.45(dd,J＝10.12&17.00Hz,1H),6.78(d,J＝7.52Hz,1H),7.12-7.19(m,2H),7.31(d,J＝8.44Hz,1H),7.46-7.53(m,3H),7.87(s,1H),7.99(d,J＝5.76Hz,1H),9.15(s,1H),9.24(s,1H),10.03(s,1H)；LCMS:m/e 346.4(M+1)。
实例3
制备N-(3-(5-甲基-4-(间甲苯基氨基)嘧啶-2-基氨基)苯基)丙烯酰胺I-2
根据下文所述的方案、步骤和中间物制备标题化合物。
A)DIPEA，n-BuOH，110℃，30分钟，MW；B)NMP，200℃，15分钟，MW；C)丙烯酰氯，NMP，0℃-30分钟，室温-30分钟。
步骤1
在110℃下对1(0.1g，0.613mmol)、2(0.066g，0.613mmol)、DIPEA(0.118g，0.919mmol)于n-BuOH(2.0mL)中的溶液进行微波照射，持续90分钟。冷却反应混合物，在减压下浓缩并借助管柱色谱法(SiO2，甲醇/氯仿混合物)进一步纯化得到的残余物，得到灰白色固体状的3(0.05g，34％)。
步骤2
对3(0.05g，0.213mmol)、4(0.046g，0.427mmol)于NMP(2.0mL)中的溶液进行微波照射(200℃，15分钟)。随后冷却反应混合物，用水(15mL)稀释，并用EtOAc萃取3次，每次15mL。用水(10mL)、盐水(10mL)洗涤合并的EtOAc萃取物，用Na2SO4干燥并在减压下浓缩，得到残余物。借助管柱色谱法(SiO2，CHCl3/MeOH：98/2)进一步纯化粗残余物，得到灰色固体状的5(0.03g，46％)。
步骤3
在0℃下，向经搅拌的5(0.025g，0.082mmol)于NMP(0.5mL)中的溶液中添加丙烯酰氯(0.073g，0.821mmol)，并在0℃下搅拌反应混合物30分钟，随后在室温下搅拌30分钟。使粗反应混合物通过氧化铝色谱柱(中性Al2O3，氯仿/甲醇混合物)，得到浅褐色固体状的I-2(0.012g，41％)。1H NMR(DMSO-d6)δppm:2.10(s,3H),2.27(s,3H),5.72(dd,J＝2&10.04Hz,1H),6.22(dd,J＝1.96&16.92Hz,1H),6.45(dd,J＝10.08&16.92Hz,1H),6.83(d,J＝7.36Hz,1H),7.09(t,J＝8.06Hz,1H),7.17(t,J＝7.78Hz,1H),7.26(d,J＝7.80Hz,1H),7.47(d,J＝1.08Hz,1H),7.53(s,1H),7.58(d,J＝8.60Hz,1H),7.78(s,1H),7.88(s,1H),8.15(s,1H),9.01(s,1H),9.99(s,1H)；LCMS:m/e 360.1(M+1)。
实例4
制备N-(3-(5-氟-4-(间甲苯基氨基)嘧啶-2-基氨基)苯基)丙烯酰胺I-3
根据下文所述的方案、步骤和中间物制备标题化合物。
A)正丁醇，DIPEA，110℃，45分钟，MW；B)NMP，200℃，10分钟，MW；C)NMP，DMAP，0℃，30分钟。
步骤1
向1(0.5g，3mmol)于正丁醇(5.0mL)中的溶液中添加2(0.64g，0.6mmol)、DIPEA(0.116g，0.8mmol)，并在110℃下以微波照射反应混合物45分钟。冷却反应混合物，用水(50mL)淬灭，并用EtOAc萃取2次，每次25mL。用水(25mL)、盐水(25mL)洗涤合并的EtOAc萃取物，用Na2SO4干燥并在减压下浓缩，得到3(0.45g，63％)，其不经进一步纯化即用于下一步骤。
步骤2
在200℃下对3(0.45g，1.8mmol)和4(0.41g，3.7mmol)于NMP(4.5mL)中的溶液进行微波照射，持续10分钟。将其冷却，用水(25mL)稀释，并用EtOAc萃取3次，每次25mL。用水(2次，每次25mL)、盐水(25mL)洗涤合并的EtOAc萃取物，用Na2SO4干燥并在减压下浓缩。借助管柱色谱法(SiO2，60-120，氯仿/乙酸乙酯：90/10)进一步纯化得到的残余物，得到浅黄色固体状的5(0.23g，41％)。
步骤3
在0℃下，于氮气氛围下向经搅拌的5(0.075g，0.24mmol)于NMP(1.5mL)中的溶液中添加DMAP(0.059g，0.48mmol)和丙烯酰氯(0.064g，0.725mmol)，并在此温度下保持反应混合物30分钟。将其用水(7.5mL)淬灭，并用EtOAc萃取3次，每次25mL。用5％柠檬酸(10mL)、水(2次，每次10mL)、盐水(10mL)洗涤合并的EtOAc萃取物，用Na2SO4干燥并在减压下浓缩。借助管柱色谱法(Al2O3，氯仿/甲醇：98/2)进一步纯化粗残余物，得到灰白色固体状的I-3(0.01g，11.3％)。1H NMR(DMSO-d6)δppm:2.27(s,3H),5.72(d,J＝9.84Hz,1H),6.22(d,J＝16.92Hz,1H),6.44(dd,J＝10.2&17.02Hz,1H),6.85(d,J＝7.12Hz,1H),7.12-7.19(m,2H),7.29(d,J＝7.68Hz,1H),7.43(d,J＝7.92Hz,1H),7.61-7.63(m,2H),7.82(s,1H),8.08(s,1H),9.23(bs,2H),10.03(s,1H)；LCMS:m/e364.2(M+1)。
实例5
制备(E)-4-(二甲基氨基)-N-(3-(5-氟-4-(间甲苯基氨基)嘧啶-2-基氨基)苯基)丁-2-烯酰胺I-4
根据下文所述的方案、步骤和中间物制备标题化合物。
A)正丁醇，DIPEA，110℃，45分钟，MW；B)NMP，200℃，10分钟，MW；C)草酰氯，CH3CN，0℃下半小时，25℃下2小时，45℃下5分钟；D)NMP，0℃到10℃，30分钟。
步骤1
对1(0.5g，3.0mmol)、2(0.32g，3.0mmol)于正丁醇(5.0mL)中的溶液进行微波照射(110℃，45分钟)。将其冷却，用水(50mL)淬灭，并用EtOAc萃取2次，每次25mL。用水(25mL)、盐水(25mL)洗涤合并的EtOAc萃取物，用Na2SO4干燥并在减压下浓缩，得到3(0.45g，63％)，其不经进一步纯化即用于下一步骤。
步骤2
对3(0.45g，1.8mmol)、4(0.41g，3.7mmol)于NMP(4.5mL)中的溶液进行微波照射(200℃，10分钟)。将其冷却，用水(25mL)稀释，并用EtOAc萃取3次，每次25mL。用水(2次，每次25mL)、盐水(25mL)洗涤合并的乙酸乙酯萃取物，用Na2SO4干燥并在减压下浓缩。借助管柱色谱法(SiO2，氯仿/乙酸乙酯：90/10)进一步纯化残余物，得到浅黄色固体状的5(0.23g，41％)。
步骤3a
在0℃下，向经搅拌的6(0.13g，0.80mmol)于CH3CN(1.0mL)中的溶液中添加草酰氯(0.122g，0.96mmol)。在0℃下搅拌反应混合物半小时，随后在室温下搅拌2小时。最后，在45℃下将其加热5分钟，冷却，并且反应混合物不经进一步纯化即用于下一步骤。
步骤3
在0℃下，向经搅拌的5(0.05g，0.16mmol)于NMP(1.0mL)中的溶液中添加7。在0℃下搅拌反应混合物30分钟，并在10℃下搅拌30分钟。用饱和碳酸氢钠溶液(5mL)淬灭，并用CH2Cl2萃取3次，每次5mL。用水(1mL)、盐水(1mL)洗涤合并的有机萃取物，并用Na2SO4干燥。在减压下浓缩，随后借助管柱色谱法(SiO2，230-400，CHCl3/MeOH，95/5)纯化，得到白色固体状的I-4(0.02g，29.4％)。1H NMR(DMSO-d6)δppm:2.21(s,6H),2.28(s,3H),3.08(bd,J＝5.6Hz,2H),6.29(d,J＝15.60Hz,1H),6.67-6.74(m,1H),6.86(d,J＝7.20Hz,1H),7.12-7.20(m,2H),7.27(d,J＝8.00Hz,1H),7.43(d,J＝8.00Hz,1H),7.62-7.64(m,2H),7.82(s,1H),8.08(d,J＝3.6Hz,1H),9.23(s,1H),9.24(s,1H),9.96(s,1H)；LCMS:m/e 421.2(M+1)。
实例6
制备N-(3-(5-甲基-4-(苯基氨基)嘧啶-2-基氨基)苯基)丙烯酰胺I-5
根据下文所述的方案、步骤和中间物制备标题化合物。
A)DIPEA，n-BuOH，110℃，30分钟，MW；B)NMP，200℃，15分钟，MW；C)丙烯酰氯，NMP，0℃-30分钟，室温-30分钟。
步骤1
在110℃下对1(0.1g，0.613mmol)、2(0.114g，1.226mmol)、DIPEA(0.118g，0.919mmol)于n-BuOH(2.0mL)中的溶液进行微波照射，持续90分钟。冷却反应混合物，在减压下浓缩并借助管柱色谱法(SiO2，60-120，甲醇/氯仿：1/9)进一步纯化残余物，得到白色固体状的3(0.08g，59％)。
步骤2
对3(0.08g，0.364mmol)、4(0.059g，0.546mmol)于NMP(2.0mL)中的溶液进行微波照射(200℃，15分钟)。冷却反应混合物，用水(15mL)稀释，并用EtOAc萃取3次，每次15mL。用水(10mL)、盐水(10mL)洗涤合并的乙酸乙酯萃取物，用Na2SO4干燥并在减压下浓缩，得到残余物。借助管柱色谱法(SiO2，60-120，CHCl3/MeOH：98/2)进一步纯化粗残余物，得到浅灰色固体状的5(0.06g，60％)。1H NMR(DMSO-d6)δppm:2.09(s,3H),4.74(s,2H),6.09-6.11(m,1H),6.77-6.85(m,2H),6.91(t,J＝1.72Hz,1H),7.02(t,J＝7.36Hz,1H),7.31(t,J＝7.52Hz,2H),7.75(d,J＝7.68Hz,2H),7.84(s,1H),8.18(s,1H),8.65(s,1H)；LCMS:m/e293.2(M+1)。
步骤3
在0℃下，向经搅拌的5(60mg，0.205mmol)于NMP(2.0mL)中的溶液中添加丙烯酰氯(0.148g，1.64mmol)，并在0℃下搅拌反应混合物30分钟。使净反应混合物通过氧化铝色谱柱(中性Al2O3，氯仿/甲醇，99/1)，得到灰白色固体状的I-5(0.013g，18.5％)。1H NMR(DMSO-d6)δppm:2.11(s,3H),5.72(dd,J＝1.92&10.04Hz,1H),6.22(dd,J＝1.92&16.92Hz,1H),6.45(dd,J＝9.32&16.92Hz,1H),7.00(t,J＝7.28Hz,1H),7.09(t,J＝8.04Hz,1H),7.23-7.30(m,3H),7.43(d,J＝8.04Hz,1H),7.75-7.77(m,2H),7.83(s,1H),7.88(s,1H),8.22(s,1H),9.00(s,1H),9.99(s,1H)；LCMS:m/e 346(M+1)。
实例7
制备N-(4-甲基-3-(5-甲基-4-(间甲苯基氨基)嘧啶-2-基氨基)苯基)丙烯酰胺I-8
根据下文所述的方案、步骤和中间物制备标题化合物。
A)DIPEA，n-BuOH，120℃，60分钟，MW；A')(BOC)2O，MeOH，-10℃，4小时；B)Pd(OAc)2，BINAP，Cs2CO3，甲苯，110℃，12小时；C)TFA，CH2Cl2，0℃-30分钟，室温-2小时；D)丙烯酰氯，NMP，0℃-30分钟，室温-30分钟。
步骤1'
在-10℃下，缓慢向经搅拌的A(5g，0.04mmol)于MeOH(75mL)中的溶液中添加(BOC)2O(11.59g，0.050mmol)。在此温度下搅拌反应物4小时，随后在减压下浓缩反应混合物。将得到的残余物溶解于EtOAc(300mL)中。用水(25mL)、盐水(25mL)洗涤，并用Na2SO4干燥。过滤，随后在减压下浓缩，得到灰白色固体状的4(2.5g，27％)。
步骤1
对1(0.5g，3.06mmol)、2(0.39g，3.06mmol)、DIPEA(0.59g，4.5mmol)于n-BuOH(5mL)中的溶液进行微波照射(120℃，30分钟)。冷却反应混合物，在减压下去除溶剂，并用水(5mL)淬灭得到的残余物。用EtOAc萃取3次，每次20mL，并用水(5mL)、盐水(5mL)洗涤合并的EtOAc层，且用Na2SO4干燥。过滤，随后在减压下浓缩，得到残余物，借助管柱色谱法(SiO2，60-120，CHCl3/MeOH：9/1)进一步纯化，得到灰白色固体状的3(0.35g，49％)。
步骤2
在氮气氛围下，使3(0.1g，0.43mmol)、4(0.14g，0.64mmol)、Pd(OAc)2(10mg，0.043mmol)、BINAP(0.013g，0.021mmol)和Cs2CO3(0.2g，1.06mmol)于经过脱气的甲苯(用氮气净化甲苯15分钟)中的溶液回流12小时。冷却反应混合物，并使其通过短垫。用EtOAc(25mL)稀释滤液，并用水(5mL)、盐水(5mL)洗涤，并且用Na2SO4干燥。过滤，随后在减压下浓缩，得到残余物，借助管柱色谱法(SiO2，60-120，CHCl3/MeOH：9/1)进一步纯化，得到灰白色固体状的5(40mg，22％)。
步骤3
在0℃下，向经搅拌的5(0.04g，0.095mmol)于无水CH2Cl2(2mL)中的溶液中添加CF3COOH(0.2mL，5体积)，并在此温度下保持反应混合物30分钟。使反应混合物达到室温，并在此温度下搅拌2小时。用冰冷的水(2mL)对其进行淬灭，用碳酸钠溶液碱化，并用EtOAc萃取2次，每次10mL。用水(2mL)、盐水(2mL)洗涤合并的EtOAc萃取物，并用Na2SO4干燥。过滤，随后在减压下浓缩，得到浅褐色固体状的6(22mg，73％)。
步骤4
在0℃下，向经搅拌的6(0.2g，0.63mmol)于NMP(4mL)中的溶液中添加丙烯酰氯(0.12g，1.25mmol)。在此温度下保持反应物30分钟，随后在室温下保持30分钟。用冰冷的水(2mL)对其进行淬灭，并用EtOAc萃取2次，每次10mL。用水(2mL)、盐水(2mL)洗涤合并的EtOAc萃取物，并用Na2SO4干燥。过滤，随后在减压下浓缩，得到残余物，借助管柱色谱法(SiO2，230-400，CHCl3/MeOH：9/1)进一步纯化，得到白色固体状的I-8(10mg，4％)。1H NMR(DMSO-d6)δppm:2.07(s,3H),2.13(s,6H),5.70(dd,J＝1.92&10.08Hz,1H),6.20(dd,J＝1.96&16.88Hz,1H),6.41(dd,J＝10.16&16.96Hz,1H),6.69(d,J＝7.36Hz,1H),6.98(t,J＝7.76Hz,1H),7.11(d,J＝8.24Hz,1H),7.41(q,J＝9.92Hz,1H),7.49-7.51(m,2H),7.73(s,1H),7.80(s,1H),7.97(s,1H),8.16(s,1H),10.00(s,1H)；LCMS:m/e 374(M+1)。
实例8
制备N-(3-(4-(3-溴苯基氨基)-5-甲基嘧啶-2-基氨基)苯基)丙烯酰胺I-9
根据下文所述的方案、步骤和中间物制备标题化合物。
A)DIPEA，正丁醇，110℃，1小时，MW；B)1.5N HCl，乙醇，90℃，30分钟，MW；C)丙烯酰氯，NMP，0℃，30min。
步骤1
对1(0.5g，3.06mmol)、2(0.53g，3.06mmol)和DIPEA(0.80mL，4.06mmol)于正丁醇(5mL)中的溶液进行微波照射(110℃，1小时)。冷却反应混合物，并在减压下浓缩，得到残余物。将残余物溶解于EtOAc(5mL)中，并用NaHCO3溶液(2mL)、水(2mL)和盐水溶液(2mL)洗涤。用Na2SO4干燥，随后在减压下浓缩，得到粗品3，借助管柱色谱法(SiO2，60-120，氯仿/甲醇，9/1)进一步纯化，得到褐色固体状的3(0.125g，13％)。
步骤2
向3(0.15g，0.5mmol)于EtOH(3mL)中的溶液中依次添加4(0.081g，0.75mmol)和1.5N HCl(0.055g，1.5mmol)。对反应混合物进行微波照射(90℃，30分钟)，冷却并在减压下浓缩。将得到的残余物溶解于EtOAc(5mL)中，并用NaHCO3溶液(2mL)、水(2mL)和盐水(2mL)洗涤。用Na2SO4干燥，过滤并在减压下浓缩，得到粗品5。借助管柱色谱法(SiO2，60-120，氯仿/甲醇，9/1)进一步纯化，得到浅褐色固体状的5(0.06g，32％)。
步骤3
在0℃下，向经搅拌的5(0.06g，0.16mmol)于NMP(1mL)中的溶液中添加丙烯酰氯(0.117g，1.29mmol)。在此温度下搅拌反应混合物30分钟，随后将其溶解于二氯甲烷(2mL)中。用NaHCO3溶液(1mL)、水(1mL)和盐水溶液(1mL)洗涤。用Na2SO4干燥，过滤并在减压下浓缩。借助管柱色谱法(SiO2，60-120，氯仿/甲醇，9/1)进一步纯化残余物，得到浅褐色固体状的I-9(0.016g，23％)。1H NMR(DMSO-d6)δppm:2.16(s,3H),5.75(dd,J＝1.72&10Hz,1H),6.23(dd,J＝1.76&16.88,Hz,1H),6.45(dd,J＝10.08&16.92Hz,1H),7.22-7.34(m,4H),7.38(d,J＝8.00Hz,1H),7.63(d,J＝8.08Hz,1H),7.77(s,1H),7.82(s,1H),7.93(s,1H),9.68(s,1H),10.26(s,1H),10.34(s,1H)；LCMS:m/e 426(M+1)。
实例9
制备3-(4-(2-(环丙基磺酰基)-1,2,3,4-四氢异喹啉-6-基氨基)-5-甲基嘧啶-2-基氨基)苯磺酰胺I-10
根据下文所述的方案、步骤和中间物制备标题化合物。
A')DPPA，苯甲醇，Et3N，甲苯，110℃，12小时；B')Pd(OH)2，甲酸铵，EtOH，回流，6小时；A)DIPEA，n-BuOH，120℃，1小时，MW；B)1.5N HCl，EtOH，回流12小时；C)环丙基磺酰氯，DIPEA，THF，室温，12小时。
步骤1-4合成骨架7的程序描述于本文中化合物I-11的实验中。
步骤5
在0℃下，于氮气氛围下向经搅拌的7(0.05g，0.0121mmol)于THF(4mL)中的溶液中依次添加DIPEA(0.023g，0.182mmol)和环丙基磺酰氯(0.031g，0.182mmol)。使反应混合物达到室温，并在此温度下保持12小时。将其溶解于EtOAc(10mL)中，用水(5mL)、盐水(5mL)洗涤，并用Na2SO4干燥。过滤，随后在减压下浓缩，得到残余物，借助管柱色谱法(SiO2，60-120，石油醚/乙酸乙酯，6/4)进一步纯化，得到黄色固体状的I-10(0.035g，56％)。1H NMR(DMSO-d6)δppm:0.97-0.1.00(m,4H),2.12(s,3H),2.60-2.66(m,1H),2.90(t,J＝5.2Hz,2H),3.52(t,J＝6Hz,2H),4.42(s,2H),7.16(d,J＝8.4Hz,1H),7.27(s,2H),7.31-7.35(m,2H),7.53(s,1H),7.59(d,J＝8.4Hz,1H),7.92(s,1H),8.03-8.04(m,2H),8.45(s,1H),9.40(s,1H)；LCMS:m/e 515(M+1)。
实例10
制备3-(4-(2-(2-氯乙酰基)-1,2,3,4-四氢异喹啉-6-基氨基)-5-甲基嘧啶-2-基氨基)苯磺酰胺I-11
根据下文所述的方案、步骤和中间物制备标题化合物。
A')DPPA，苯甲醇，Et3N，甲苯，110℃，12小时；B')Pd(OH)2，甲酸铵，EtOH，回流，6小时；A)DIPEA，n-BuOH，120℃，1小时，MW；B)1.5N HCl，EtOH，回流12小时；C)Cl-CH2-COCl，Et3N，THF，室温，12小时。
步骤1
在氮气下，向经搅拌的1(1.5g，5.4mmol)于甲苯(15mL)中的溶液中添加DPPA(2.17g，8.11mmol)、Et3N(1.05mL，8.11mmol)和苯甲醇(0.876g，8.11mmol)。使反应混合物回流12小时，冷却并用乙酸乙酯(100mL)稀释。用水(5mL)、盐水溶液(5mL)洗涤，并用Na2SO4干燥。过滤并在减压下浓缩，并且借助管柱色谱法(SiO2，60-120，氯仿/甲醇，9/1)纯化残余物，得到白色固体状的2(2.0g，97％)。
步骤2
向经搅拌的2(2.2g，5.75mmol)于EtOH(25mL)中的溶液中添加甲酸铵(3.68g，57.5mmol)，并使反应混合物回流6小时。冷却反应混合物，经垫过滤，并在减压下浓缩滤液，得到深褐色油状的3(1.3g，91％)，其不经进一步纯化即使用。
步骤3
在120℃下对3(1.4g，5.56mmol)、4(0.912g，5.56mmol)和DIPEA(1.077g，8.3mmol)于n-BuOH(15mL)中的溶液进行微波照射，持续45分钟。冷却反应混合物并在减压下浓缩。将残余物溶解于乙酸乙酯(20mL)中，并用水(5mL)和盐水(5mL)洗涤。用Na2SO4干燥，随后在减压下浓缩，得到残余物，借助管柱色谱法(SiO2，60-120，氯仿/甲醇，9/1)纯化，得到米黄色固体状的5(1.1g，52％)。
步骤4
向经搅拌的5(0.25g，0.66mmol)于乙醇(5mL)中的溶液中添加6(0.126g，0.73mmol)和催化量的HCl水溶液，并使反应混合物在100℃下回流12小时。冷却反应混合物，过滤沉淀的固体，并用乙醚洗涤，且在高真空下干燥，得到浅黄色固体状的7(0.24g，82％)。
步骤5
向经搅拌的7(0.2g，0.487mmol)于NMP(5mL)中的溶液中添加Et3N(0.094g，0.731mmol)。将溶液冷却到0℃，并向其中添加氯乙酰氯(0.082g，0.731mmol)。使反应混合物达到室温，并在此温度下搅拌12小时。用冰冷的水(2mL)对其进行淬灭，并用乙酸乙酯萃取3次，每次5mL。用盐水溶液(2mL)洗涤合并的乙酸乙酯萃取物，用无水Na2SO4干燥，过滤并在减压下浓缩。借助管柱色谱法(SiO2，60-120，氯仿/甲醇，9/1)进一步纯化得到的残余物，得到浅黄色固体状的I-11(0.038g，16％)。1H NMR(DMSO-d6)δppm:2.11(s,3H),2.77-2.89(m,2H),3.70-3.72(m,2H),4.49(d,J＝2.92Hz,2H),4.63(d,J＝23.56Hz,2H),7.15-7.17(m,1H),7.24(s,2H),7.30-7.32(m,2H),7.50-7.65(m,2H),7.91(s,1H),8.04-8.05(m,2H),8.27(s,1H),9.31(s,1H)，LCMS:m/e 486.8(MH+)。
实例11
制备N-(3-(5-甲基-4-(4-苯氧基苯基氨基)嘧啶-2-基氨基)苯基)丙烯酰胺I-23
根据下文所述的方案、步骤和中间物制备标题化合物。
A)DIPEA，正丁醇，100℃，1小时，MW；B)浓HCl，n-BuOH，160℃，20分钟，MW；C)丙烯酰氯0℃，室温，1小时。
步骤1
对1(0.2g，1.2mmol)、2(0.12g，0.95mmol)和DIPEA(0.23g，1.78mmol)于n-BuOH(2mL)中的溶液进行微波照射(100℃，1小时)。随后冷却反应混合物，在减压下浓缩并将残余物溶解于EtOAc(5mL)中。用NaHCO3溶液(2mL)、水(2mL)、盐水(2mL)洗涤，随后用无水Na2SO4干燥。在减压下浓缩，随后借助管柱色谱法(SiO2，60-120，氯仿/甲醇，9/1)纯化，得到浅褐色固体状的3(0.11g，28.9％)。
步骤2
向3(0.11g，0.3mmol)、4(0.114g，1.05mmol)于正丁醇(1mL)中的溶液中添加浓HCl(1滴)，并对混合物进行微波照射(165℃，10分钟)。冷却反应混合物，在减压下浓缩并将残余物溶解于EtOAc(5mL)中。用NaHCO3溶液(2mL)、水(2mL)和盐水(2mL)洗涤。用Na2SO4干燥，随后在减压下浓缩，得到残余物，借助管柱色谱法(SiO2，60-120，氯仿/甲醇，9/1)纯化，得到褐色固体状的5(0.08g，65％)。
步骤3
在0℃下，向经搅拌的5(0.015g，0.03mmol)于NMP(1mL)中的溶液中添加丙烯酰氯(0.005g，0.05mmol)。使反应混合物达到室温，并在此温度下保持1小时。用二氯甲烷(2mL)稀释反应混合物，并用NaHCO3溶液(1mL)、水(1mL)和盐水(1mL)洗涤。用Na2SO4干燥，随后在减压下浓缩，得到残余物，借助管柱色谱法(SiO2，60-120，氯仿/甲醇，9/1)进一步纯化，得到褐色固体状的I-23(0.004g，23％)。400MHz,MeOD:δ2.14(s,3H),5.71(d,J＝11.20Hz,1H),6.30-6.44(m,2H),6.94-6.99(m,4H),7.07-7.15(m,2H),7.22(d,J＝7.2Hz,1H),7.34-7.36(m,3H),7.63(d,J＝8.8Hz,2H),7.79(s,2H)；LCMS:m/e 437(M+1)。
实例12
制备N-(3-(5-甲基-2-(3-氨磺酰基苯基氨基)嘧啶-4-基氨基)苯基)丙烯酰胺I-33
根据下文所述的方案、步骤和中间物制备标题化合物。
A)DIPEA，n-BuOH，120℃，30分钟，MW；B)1.5N HCl，乙醇，100℃，12小时；C)NMP，0℃到室温，1小时。
步骤1
对1(0.5g，3.06mmol)、1(0.49g，4.59mmol)和DIPEA(0.59g，4.59mmol)于正丁醇(8mL)中的溶液进行微波照射(120℃，30分钟)。将其冷却，用水(5mL)淬灭，并用乙酸乙酯萃取3次，每次20mL。用盐水溶液(5mL)洗涤合并的乙酸乙酯层，用Na2SO4干燥，过滤并在减压下浓缩。借助管柱色谱法(SiO2，60-120，氯仿/乙酸乙酯，9/1)进一步纯化残余物，得到浅褐色固体状的1(0.25g，34.77％)。
步骤2
向经搅拌的3(0.1g，0.48mmol)于乙醇(2mL)中的溶液中添加4(0.070g，0.42mmol)和催化量的1.5N HCl(3滴)，随后加热到100℃，保持12小时。随后冷却反应混合物，分离出固体，过滤并用醚5(0.1g粗品)洗涤，以原样用于下一步骤。
步骤3
在0℃下，向经搅拌的5(0.1g，0.27mmol)于NMP(2mL)中的溶液中添加丙烯酰氯(0.037g，0.425mmol)，随后在室温下搅拌1小时，接着用水(4mL)淬灭反应混合物，并用NaHCO3碱化，随后用乙酸乙酯(5mL)进行萃取，用盐水溶液(1mL)洗涤合并的有机层，用无水Na2SO4干燥，过滤，接着浓缩，随后使用制备型HPLC纯化粗品，得到灰白色固体状的I-33(0.07g，6％)。1H NMR(MeOD)δppm:2.17(s,3H),5.78(dd,J＝2.36&9.52Hz,1H),6.34-6.48(m,2H),7.26-7.43(m,5H),7.87(s,1H),7.96-8.03(m,3H)；LCMS:m/e 425(M+1)。
实例13
制备N-(3-(甲基(5-甲基-2-(苯基氨基)嘧啶-4-基)氨基)苯基)丙烯酰胺I-34
根据下文所述的方案、步骤和中间物制备标题化合物。
A)Pd(OAC)2，BINAP，Cs2CO3，甲苯，100℃，16小时；B)NaH，CH3I，THF，0℃-30分钟，室温-16小时；C)苯胺，浓HCl，乙醇，90℃，60分钟；D)H2，Pd/C，乙醇，16小时；E)丙烯酰氯，NMP，0℃，1小时。
步骤1
向经搅拌的2(1.0g，6.0mmol)于甲苯(30.0mL)中的溶液中添加1(0.84g，6.0mmol)、BINAP(0.186g，0.3mmol)、Cs2CO3(4.87g，15.0mmol)。通过用氮气净化15分钟来使反应混合物脱气。随后将Pd(OAc)2(0.134g，0.6mmol)添加到反应混合物中，并在100℃下，于氮气氛围下加热反应混合物16小时。随后将其冷却，用乙酸乙酯(30mL)稀释，并经过滤。用水(2次，每次25mL)、盐水(25mL)洗涤滤液，用Na2SO4干燥并在减压下浓缩。借助管柱色谱法(SiO2，60-120目，乙酸乙酯/己烷：10/90)进一步纯化得到的残余物，得到固体，用乙醚洗涤，得到浅黄色固体状的3(0.6g，37％)。
步骤2
在0℃下，向经搅拌的NaH(0.1g，2.5mmol，60％于石蜡油中的分散液)于无水THF(10.0mL)中的混合物中添加3(0.5g，1.89mmol)，并在此温度下搅拌反应混合物30分钟。向其中添加CH3I(0.305g，2.15mmol)，并使反应物达到室温，并在此温度下搅拌16小时。用水(25mL)稀释反应混合物，并用EtOAc萃取3次，每次25mL。用水(25mL)、盐水(25mL)洗涤合并的EtOAc萃取物，用Na2SO4干燥并在减压下浓缩，得到残余物。借助管柱色谱法(SiO2，CHCl3/MeOH：99/1)进一步纯化粗残余物，得到浅黄色固体状的4(0.12g，22.7％)。
步骤3
向4(120mg，0.431mmol)于EtOH(2mL)中的溶液中添加浓HCl(0.044g，1.2mmol)和苯胺(0.16g，1.72mmol)，并在密封的压力管中于90℃下加热反应混合物1小时。冷却反应混合物，通过在减压下浓缩来去除溶剂，并用10％NaHCO3(10.0mL)稀释得到的残余物。用EtOAc萃取3次，每次15mL，并用水(15mL)、盐水(15mL)洗涤合并的EtOAc萃取物，用Na2SO4干燥。在减压下浓缩得到残余物，借助管柱色谱法(SiO2，CHCl3/MeOH：99/1)进一步纯化残余物，得到浅黄色固体状的5(0.11g，76％)。
步骤4
向5(0.110g，0.328mmol)于乙醇(50mL)中的溶液中添加10％钯/炭(0.022g)，并在室温下，于氢气氛围下搅拌反应混合物16小时。使其经过滤，并在减压下浓缩，得到残余物。借助管柱色谱法(SiO2，60-120，甲醇/氯仿：1/99)纯化残余物，得到无色粘稠液体状的6(0.07g，69.9％)。
步骤5
在0℃下，向经搅拌的6(0.070g，0.23mmol)于NMP(1.5mL)中的溶液中添加丙烯酰氯(0.083g，0.916mmol)，并在0℃下搅拌反应混合物1小时。用10％碳酸氢钠溶液(15mL)淬灭，并过滤沉淀析出的固体，用冷水(5mL)、己烷(5mL)洗涤。在减压下干燥固体2小时，得到浅黄色固体状的I-34(0.033g，40％)。1H NMR(DMSO-d6)δppm:δ1.47(s,3H),3.45(s,3H),5.74(dd,J＝Hz,1H),6.22(dd,J＝2.0&16.98Hz,1H),6.38(dd,J＝10&16.94Hz,1H),6.85-6.91(m,2H),7.21-7.25(m,2H),7.32(t,J＝8.02Hz,1H),7.43-7.47(m,2H),7.77-7.79(m,2H),7.90(s,1H),9.22(s,1H),10.18(s,1H)；LCMS:m/e 360.8(M+1)。
实例14
制备N-(3-(5-甲基-2-(3-(丙-2-炔基氧基)苯基氨基)嘧啶-4-基氨基)苯基)丙烯酰胺I-35
根据下文所述的方案、步骤和中间物制备标题化合物。
A)K2CO3，CH3CN，65℃，8小时；B)铁粉，NH4Cl，MeOH，H2O，80℃，4小时；C)1,3-苯二胺，DIPEA，n-BuOH，120℃，30分钟，MW；D)浓HCl，无水乙醇，110℃，2小时；E)NMP，0℃，1小时。
步骤1
向经搅拌的1a(4g，0.0287mol)和K2CO3(5.6g，0.0574mol)于CH3CN(15mL)中的溶液中添加炔丙基溴(4.1g，0.0345mol)，并使所得混合物回流8小时。随后冷却反应混合物，用水淬灭，并用EtOAc萃取3次，每次50mL。用水(20mL)、盐水(20mL)洗涤合并的EtOAc萃取物，并用Na2SO4干燥。过滤，随后在减压下浓缩，得到微褐色固体状的2b，其不经进一步纯化即使用。
步骤2
向经搅拌的2b于甲醇(30mL)与水(30mL)的混合物中的溶液中分别添加NH4Cl(10.3g，0.194mol)和铁粉(6.8g，0.121mol)。在80℃下使所得混合物回流4小时。冷却反应混合物，用甲醇稀释并经垫过滤。在减压下浓缩滤液，并将残余物溶解于EtOAc中。用水、盐水洗涤，用Na2SO4干燥并在减压下浓缩，得到残余物。借助管柱色谱法(SiO2，60-120，重力管柱色谱法，用CHCl3/MeOH：96/4洗脱预期的产物)进一步纯化残余物，得到微褐色固体状的3(3.2g，91％)。
步骤3
对2,4-二氯-5-甲基嘧啶1(0.3g，0.0018mol)、1,3-苯二胺(0.24g，0022mol)、DIPEA(0.35g，0.0027mol)于n-BuOH(3mL)中的溶液进行微波照射(120℃，30分钟)。冷却反应混合物，用水(15mL)淬灭，并用EtOAc萃取3次，每次15mL。用水(20mL)、盐水(20mL)洗涤合并的EtOAc萃取物，用Na2SO4干燥并在减压下浓缩。借助管柱色谱法(SiO2，60-120)进一步纯化得到的残余物，得到微褐色固体状的2(0.15g，35％)。
步骤4
将2(0.15g，0.006mol)和3(0.37g，0.0025mol)放入压力管中，并向其中依次添加无水EtOH(3mL)和浓HCl(0.04g，0.0012mol)。将所述管的螺纹拧紧，并在120℃下加热2小时。随后冷却反应混合物，在减压下去除溶剂，并将得到的残余物溶解于EtOAc(10mL)中。用水(4mL)、NaHCO3(4mL)和盐水(5mL)洗涤。用Na2SO4干燥，随后在减压下浓缩，得到残余物，借助管柱色谱法(SiO2，60-120，重力管柱色谱法，以CHCl3/MeOH：94/6洗脱预期的化合物)进一步纯化，得到浅褐色固体状的4(125mg，56％)。
步骤5
在0℃下，向经搅拌的4(0.1g，0.002mol)于NMP(8mL)中的溶液中逐滴添加丙烯酰氯(0.1g，0.001mol)。在此温度下保持反应物10分钟，随后使其达到室温并在此温度下搅拌1.5小时。接着用10％碳酸氢钠溶液(8mL)淬灭，并用EtOAc萃取2次，每次15mL。用水(10mL)、盐水(10mL)洗涤合并的EtOAc萃取物，用Na2SO4干燥并在减压下浓缩。借助管柱色谱法(SiO2，60-120，重力管柱色谱法，用CHCl3/MeOH：90/10洗脱预期的化合物)纯化得到的残余物，得到灰白色固体状的I-35(20mg，18％)。1H NMR(DMSO-d6)δppm:2.11(s,3H),3.51(s,1H),4.61(s,2H),5.74(d,J＝9.08Hz,1H),6.25(d,J＝15.84Hz,1H),6.45(s,2H),7.02(s,1H),7.27-7.45(m,5H),7.91(d,J＝8.84Hz,2H),8.36(s,1H),8.93(s,1H),10.09(s,1H)，LCMS:m/e 400(M+1)。
实例15
制备(E)-4-(二甲基氨基)-N-(3-(5-甲基-2-(苯基氨基)嘧啶-4-基氨基)苯基)丁-2-烯酰胺I-38
根据下文所述的方案、步骤和中间物制备标题化合物。
A)DIEA，n-BuOH，120℃，30分钟，MW；B)NMP，200℃，10分钟，MW；C))草酰氯，CH3CN，0℃下30分钟，25℃下2小时，45℃下5分钟，D)NMP，0℃，1小时。
步骤1
在120℃下对1(2.0g，12mmol)、2(2.0g，18mmol)、DIPEA(2.33g，18mmol)于n-BuOH(20.0mL)中的溶液进行微波照射，持续30分钟。随后用水(100mL)淬灭反应混合物，用EtOAc萃取3次，每次100mL。用水(100mL)、盐水(100mL)洗涤合并的EtOAc萃取物，用Na2SO4干燥并在减压下浓缩。借助管柱色谱法(SiO2，60-120目，EtOAc/CHCl3：15/85)进一步纯化得到的残余物，得到深褐色固体状的3(1.3g，45％)。
步骤2
对3(1.0g，4.27mmol)、4(1.5g，16.12mmol)于NMP(10mL)中的溶液进行微波照射(200℃，10分钟)。随后冷却反应混合物，用水(100mL)稀释，并用EtOAc萃取3次，每次100mL。用水(100mL)、盐水(100mL)洗涤合并的EtOAc萃取物，用Na2SO4干燥并在减压下浓缩，得到残余物。借助管柱色谱法(SiO2，60-120，CHCl3/MeOH：98/2)进一步纯化粗残余物，得到浅褐色固体状的5(0.5g，40.3％)。
步骤2'
在0℃下，向经搅拌的6'(70mg，0.42mmol)于CH3CN(1.0mL)中的溶液中添加草酰氯(80mg，0.62mmol)。在0℃下搅拌反应混合物半小时，随后在室温下搅拌2小时。最后，在45℃下将其加热5分钟，冷却，并且反应混合物不经进一步纯化即用于下一步骤。
步骤3
在0℃下，向经搅拌的5(75mg，0.12mmol)于NMP(1mL)中的溶液中添加6。在0℃下搅拌反应混合物1小时，用冷水(5mL)淬灭，用Et3N碱化，并用CH2Cl2萃取3次，每次10mL。用水(5mL)、盐水(5mL)洗涤合并的有机萃取物，并用Na2SO4干燥。在减压下浓缩，随后经硅胶(60-120)使用含5％甲醇的氯仿进行纯化，得到褐色粘性固体状的粗化合物(20mg)，再将其溶解于二氯甲烷中，并与10％碳酸氢盐溶液一起搅拌30分钟，分离出二氯甲烷层，用Na2SO4干燥，并浓缩，得到褐色固体状的I-38(8mg，17％)。1H NMR(DMSO-d6)δppm:2.15(s,3H),2.32(s,6H),3.21(d,J＝5.76Hz,2H),6.27(d,J＝15.36Hz,1H),6.84-6.93(m,2H),7.14(t,J＝7.52Hz,2H),7.27-7.33(m,2H),7.44(dd,J＝2.04Hz&5.08Hz,1H),7.53(d,J＝7.72Hz,2H),7.80(s,1H),8.00(s,1H)；LCMS:m/e402.8(M+1)。
实例16
制备N-(4-(5-甲基-2-(苯基氨基)嘧啶-4-基氨基)苯基)丙烯酰胺I-39
根据下文所述的方案、步骤和中间物制备标题化合物。
A)DIPEA，n-BuOH，110℃，45分钟，MW；B)浓HCl，n-BuOH，150℃，10分钟，MW；C)丙烯酰氯，NMP，0℃-30分钟，室温-2小时。
步骤1
对1(0.4g，2.4mmol)、2(0.3g，2.6mmol)、DIPEA(0.46g，3.6mmol)于n-BuOH(10mL)中的溶液进行微波照射(110℃，45分钟)。冷却反应混合物，用水(20mL)淬灭，并用EtOAc萃取3次，每次15mL。用水(20mL)、盐水(20mL)洗涤合并的EtOAc萃取物，用Na2SO4干燥并在减压下浓缩。借助管柱色谱法(SiO2，60-120，CHCl3/MeOH：99/1)纯化残余物，得到灰白色固体状的3(350mg，62％)。
步骤2
对3(0.2g，0.8mmol)、4(0.63g，6.8mmol)和浓HCl(0.03g，0.8mmol)于n-BuOH(10mL)中的溶液进行微波照射(150℃，10分钟)。随后冷却反应混合物，用水(10mL)稀释，用10％碳酸氢钠溶液碱化，并用EtOAc萃取3次，每次15mL。用水(15mL)、盐水(15mL)洗涤合并的EtOAc萃取物，用Na2SO4干燥并在减压下浓缩。借助管柱色谱法(SiO2，60-120，CHCl3/MeOH：97/3)纯化粗残余物，得到褐色粘性固体状的5(110mg，47％)。
步骤3
在0℃下，向经搅拌的5(0.06g，0.2mmol)于NMP(2mL)中的溶液中添加丙烯酰氯(0.03g，0.3mmol)。在相同温度下将其搅拌20分钟，随后在室温下搅拌2小时。用水淬灭反应混合物，用10％碳酸氢钠溶液碱化，并用EtOAc萃取3次，每次10mL。用水(10mL)、盐水(10mL)洗涤合并的EtOAc层，用Na2SO4干燥并在减压下浓缩。借助管柱色谱法(SiO2，60-120)纯化残余物，最后借助制备型HPLC纯化，得到灰白色固体状的I-39(10mg，16％)。1H NMR(DMSO-d6)δppm:2.10(s,3H),5.71-5.76(m,1H),6.25(dd,J 2.04&16.96Hz,1H),6.45(dd,J＝10.08&16.92Hz,1H),6.84(t,J＝7.30Hz,1H),7.14-7.18(m,2H),7.62-7.68(m,6H),7.86(s,1H),8.26(s,1H),8.94(s,1H),10.11(s,1H)，LCMS:m/e 346(M+1)。
实例17
制备N-(3-(5-甲基-2-(苯基氨基)嘧啶-4-基氨基)苯基)丙酰胺IR-7
根据下文所述的方案、步骤和中间物制备标题化合物。
A)DIPEA，n-BuOH，120℃，30分钟，MW；B)NMP，200℃，10分钟，MW；C)6，NMP，0℃，60分钟。
步骤1
在120℃下对1(2.0g，12mmol)、2(2.0g，18mmol)、DIPEA(2.33g，18mmol)于n-BuOH(20.0mL)中的溶液进行微波照射，持续30分钟。随后用水(100mL)淬灭反应混合物，用EtOAc萃取3次，每次100mL。用水(100mL)、盐水(100mL)洗涤合并的EtOAc萃取物，用Na2SO4干燥并在减压下浓缩。借助管柱色谱法(SiO2，60-120目，EtOAc/CHCl3：15/85)进一步纯化得到的残余物，得到深褐色固体状的3(1.3g，45％)。
步骤2
对3(1.0g，4.27mmol)、4(1.5g，16.12mmol)于NMP(10mL)中的溶液进行微波照射(200℃，10分钟)。随后冷却反应混合物，用水(100mL)稀释，并用EtOAc萃取3次，每次100mL。用水(100mL)、盐水(100mL)洗涤合并的EtOAc萃取物，用Na2SO4干燥并在减压下浓缩，得到残余物。借助管柱色谱法(SiO2，CHCl3/MeOH：98/2)进一步纯化粗残余物，得到浅褐色固体状的5(0.5g，40.3％)。
步骤3
在0℃下，向经搅拌的5(75mg，0.25mmol)于NMP(1.0mL)中的溶液中添加丙酰氯(6)(72mg，0.75mmol)，并在0℃下搅拌反应混合物60分钟。随后用水(5mL)淬灭反应混合物，用Et3N碱化，并用EtOAc萃取3次，每次10mL。用水(10mL)、盐水(10mL)洗涤合并的EtOAc萃取物，用Na2SO4干燥并在减压下浓缩。借助管柱色谱法(SiO2，230-400，甲醇/氯仿：2/98)进一步纯化得到的残余物，得到灰白色固体状的IR-7(0.025g，28.73％)。1H NMR(DMSO-d6)δppm:1.08(t,J＝7.6Hz,3H),2.11(s,3H),2.31(q,J＝7.6Hz,2H),6.81(t,J＝7.2Hz,1H),7.11(t,J＝8Hz,2H),7.21-7.25(m,1H),7.31(d,J＝8.40Hz,1H),7.36(d,J＝8.00Hz,1H),7.66(d,J＝8.40Hz,2H),7.86(s,1H),7.89(s,1H),8.35(s,1H),8.93(s,1H),9.81(s,1H)；LCMS:m/e 348.3(M+1)。
实例18
制备N-(4-甲基-3-(4-(吡啶-3-基)嘧啶-2-基氨基)苯基)丙烯酰胺I-56
根据下文所述的方案、步骤和中间物制备标题化合物。
A)丙烯酰氯，Et3N，DMF，室温，12小时
步骤1
在0℃下，于氮气氛围下向经搅拌的1(0.15g，0.54mmol)和Et3N(0.11g，1.08mmol)于DMF(1mL)中的溶液中逐滴添加丙烯酰氯(0.09g，1.08mmol)。使反应混合物达到室温，并且再搅拌12小时。用冰冷的水(2mL)对其进行淬灭，并用EtOAc萃取2次，每次15mL。用盐水(2mL)洗涤合并的EtOAc萃取物，用Na2SO4干燥并在减压下浓缩，得到粗残余物。借助制备型HPLC进一步纯化残余物，并得到浅黄色固体状的I-56(0.060g，33％)。1H NMR(DMSO-d6)δppm:2.19(s,3H),5.72(dd,J＝2&10.08Hz,1H),6.22(dd,J＝2&16.92Hz,1H),6.45(dd,J＝10&17Hz,1H),7.16(d,J＝8.36Hz,1H),7.32(dd,J＝1.92&8.16Hz,1H),7.42(d,J＝5.12Hz,1H),7.50-7.53(m,1H),7.95(d,J＝1.68Hz,1H),8.45(dd,J＝6.16&8.16Hz,1H),8.49(d,J＝5.16Hz,1H),8.68(dd,J＝1.56&4.76Hz,1H),8.95(s,1H),9.25(d,J＝1.56Hz,1H),10.08(s,1H)；LCMS:m/e 332.4(M+1)。
实例19
制备具有含烯酮的弹头的化合物的一般方法，
例如制备3-甲基-1-(3-(5-甲基-2-(苯基氨基)嘧啶-4-基氨基)苯基)丁-2-烯-1-酮I-47
根据下文所述的方案、步骤和中间物制备标题化合物。所属领域技术的技术人员也应了解，I-47是具有含烯酮的弹头的例示性化合物，而且可按与下文所述的方案、步骤和相应中间物实质上类似的方式合成其它具有含烯酮的弹头的化合物。
使化合物1与2在三乙胺存在下偶合，得到化合物3。在高温下，用苯胺处理化合物3，得到化合物4。用氢氧化钾使化合物4皂化，得到酸化合物5，使用EDC使其与N-O-二甲基羟胺偶合，得到化合物6。在低温下处理化合物6，得到例示性化合物I-47。
实例20
制备N-(3-(5-氟-2-(4-(2-甲氧基乙氧基)苯基氨基)嘧啶-4-基氨基)苯基)丙烯酰胺I-182
根据下文所述的方案、步骤和中间物制备标题化合物。
A)2，DIPEA，THF，回流；B)4，叔戊醇，HOAc，回流；C)TFA，DCM；D)7，DIPEA，THF，-10℃。
步骤1
将1(800mg，4.8mmoL)、2(996mg，4.8mmoL)和汉尼格氏碱(Hunig's base)(948μL，5.75mmoL)溶解于THF(20mL)中。在回流下加热反应混合物过夜。冷却后，使其在水/盐水(10mL)之间分配，搅动并分离各层。用硫酸钠干燥有机相，并经由旋转蒸发去除溶剂。用EtOAc和庚烷滴定，过滤后得到1g白色固体。LC/MS(RT＝2.03/(M+1))339.1。
步骤2
将3(800mg，2.37mmoL)和4(576mg，2.84mmoL)悬浮于叔戊醇(14mL)和乙酸(5滴)中。加热到回流，保持4小时。冷却后，经由旋转蒸发去除溶剂。使深色油状物在水/盐水与THF(各10mL)之间分配，搅动，并分离各层，并且用硫酸钠干燥有机相。经由旋转蒸发去除溶剂，得到0.55g紫色固体。LC/MS(RT＝2.997/(M+1))470.2。从水层中又结晶出150mg不含(BOC)保护基的产物。
步骤3
向6(550mg，1.17mmol)于DCM(20mL)中的溶液中添加TFA(2mL)。搅拌30分钟，在室温下搅拌4小时；经由旋转蒸发去除溶剂，并使油状物在冷的(0℃)饱和碳酸氢钠(10mL)与EtOAc(10mL)之间分配，搅动并分离各层。用硫酸钠干燥有机相，并经由旋转蒸发去除溶剂，得到深色油状物。使用combiflash系统，使用20％到100％的庚烷/EtOAc梯度进行快速色谱分离，得到309mg浅粉红色固体。LC/MS(RT＝2.78/(M+1))370.2。
步骤4
在水/冰甲醇浴(-10℃)中冷却6(309mg，0.84mmol)于THF(10mL)中的溶液。向此溶液中添加7(71μL，0.88mmoL)，搅拌10分钟，随后添加汉尼格氏碱(145μL，0.88mmoL)，并搅拌10分钟。使其在水/盐水(10mL)之间分配，搅动并分离各层。用硫酸钠干燥有机相。经由旋转蒸发去除溶剂，并用乙醚湿磨，过滤后，得到285mg(80％)灰白色固体。LC/MS(RT＝2.79/(M+H))424.2。
实例21
制备N-(3-(2-(3-氯-4-(吡啶-2-基甲氧基)苯基氨基)-5-氟嘧啶-4-基氨基)苯基)丙烯酰胺I-86
根据实例20中所述的方案、步骤和中间物，在步骤2中使用3-氯-4-(吡啶-2-基甲氧基)苯胺代替4，来制备标题化合物。LC/MS(RT＝2.87/(M+H))491.1。
实例22
制备N-(3-(5-氟-2-(4-(2-(2-氧代吡咯烷-1-基)乙氧基)苯基氨基)嘧啶-4-基氨基)苯基)丙烯酰胺I-92
根据实例20中所述的方案、步骤和中间物，在步骤2中使用1-(2-(4-氨基苯氧基)乙基)吡咯烷-2-酮代替4，来制备标题化合物。LC/MS(RT＝2.718/(M+H))477.1。
实例23
制备N-(3-(5-氟-2-(4-(1-羟基-2-甲基丙-2-基氧基)苯基氨基)嘧啶-4-基氨基)苯基)丙烯酰胺I-93
根据实例20中所述的方案、步骤和中间物，在步骤2中使用2-(4-氨基苯氧基)-2-甲基丙-1-醇代替4，来制备标题化合物。LC/MS(RT＝2.724/(M+H))438.1。
实例24
制备N-(3-(5-氟-2-(6-异丙氧基吡啶-3-基氨基)嘧啶-4-基氨基)苯基)丙烯酰胺I-172
根据实例20中所述的方案、步骤和中间物，在步骤2中使用6-异丙氧基吡啶-3-胺代替4，来制备标题化合物。LC/MS(RT＝2.878/(M+H))409.2。
实例25
制备N-(3-(5-氟-2-(2-氧代吲哚啉-5-基氨基)嘧啶-4-基氨基)苯基)丙烯酰胺I-181
根据实例20中所述的方案、步骤和中间物，在步骤2中使用5-氨基吲哚啉-2-酮代替4，来制备标题化合物。LC/MS(RT＝2.617/(M+H))405.1。
实例26
制备N-(2-氯-5-(5-氟-2-(4-(2-甲氧基乙氧基)苯基氨基)嘧啶-4-基氨基)苯基)丙烯酰胺I-108
根据实例20中所述的方案、步骤和中间物，在步骤1中使用5-氨基-2-氯苯基氨基甲酸叔丁酯代替2，来制备标题化合物。LC/MS(RT＝2.852/(M+H))458.1。
实例27
制备N-(2-氯-5-(5-氟-2-(6-异丙氧基吡啶-3-基氨基)嘧啶-4-基氨基)苯基)丙烯酰胺I-107
根据实例20中所述的方案、步骤和中间物，在步骤1中使用5-氨基-2-氟苯基氨基甲酸叔丁酯代替2，并在步骤2中使用6-异丙氧基吡啶-3-胺代替4，来制备标题化合物。LC/MS(RT＝2.938/(M+H))443.1。
实例28
制备N-(2-氟-5-(5-氟-2-(4-(2-甲氧基乙氧基)苯基氨基)嘧啶-4-基氨基)苯基)丙烯酰胺I-87
根据实例20中所述的方案、步骤和中间物，在步骤1中使用5-氨基-2-氟苯基氨基甲酸叔丁酯代替2，来制备标题化合物。LC/MS(RT＝2.797/(M+H))442.0。
实例29
制备N-(3-(5-氟-2-(4-((1-甲基哌啶-4-基)甲氧基)苯基氨基)嘧啶-4-基氨基)苯基)丙烯酰胺I-90
根据下文所述的方案、步骤和中间物制备标题化合物。
A)2，DIPEA，THF，回流；B)4，Pd(OAc)2，X-Phos，CsCO3，二噁烷，回流，12小时；C)TFA，DCM；D)7，DIPEA，THF，-10℃。
步骤1
将1(800mg，4.8mmoL)、2(996mg，4.8mmoL)和汉尼格氏碱(948μL，5.75mmoL)溶解于THF(20mL)中。在回流下加热反应混合物过夜。冷却后，使其在水/盐水(10mL)之间分配，搅动并分离各层。用硫酸钠干燥有机相，并经由旋转蒸发去除溶剂。用EtOAc和庚烷滴定，过滤后得到1g白色固体。LC/MS(RT＝2.03/(M+1))339.1。
步骤2
将3(205mg，0.61mmoL)和4(150mg，0.73mmoL)溶解于二噁烷(4mL)中。使溶液脱气1分钟。依序添加乙酸钯(20mg，5moL％)、X-Phos配体(35mg，10moL％)和CsCO3(325mg，1.2mmoL)。使悬浮液脱气1分钟，并在氩气氛围下，将混合物加热到回流，保持12小时。冷却后，经由旋转蒸发去除溶剂。使深色油状物在水/盐水与EtOAc(各5mL)之间分配，搅动，滤出沉淀物，并分离滤液各层。用硫酸钠干燥有机相。经由旋转蒸发去除溶剂，得到深色油状物。使用0到30％的庚烷/EtOAc梯度进行快速色谱分离，得到浅黄色油状物。LC/MS(RT＝3.043/(M+1))523.2。
步骤3
向5(144mg，0.27mmol)于DCM(10mL)中的溶液中添加TFA(1mL)。搅拌30分钟，在室温下搅拌12小时；经由旋转蒸发去除溶剂，并使油状物在冷的(0℃)饱和碳酸氢钠(5mL)与EtOAc(5mL)之间分配，搅动并分离各层。用硫酸钠干燥有机相，并经由旋转蒸发去除溶剂，得到浅黄色泡沫状物。LC/MS(RT＝2.723/(M+1))423.1。
步骤4
在水/冰甲醇浴(-10℃)中冷却6(105mg，0.25mmol)于THF(3mL)中的溶液。向此溶液中添加7(21μL，0.26mmoL)，搅拌10分钟，随后添加汉尼格氏碱(51μL，0.26mmoL)，并搅拌10分钟。使其在水/盐水(5mL)之间分配，搅动并分离各层。用硫酸钠干燥有机相。经由旋转蒸发去除溶剂，得到浅黄色泡沫状物。LC/MS(RT＝2.726/(M+H))477.1。
实例30
制备N-(3-(5-氟-2-(6-((2-甲氧基乙基)(甲基)氨基)吡啶-3-基氨基)嘧啶-4-基氨基)苯基)丙烯酰胺I-77
根据实例29中所述的方案、步骤和中间物，在步骤2中使用N2-(2-甲氧基乙基)-N2-甲基吡啶-2,5-二胺代替4，来制备标题化合物。LC/MS(RT＝2.739/(M+H))438.1。
实例31
制备1-(6-(5-氟-2-(6-甲氧基吡啶-3-基氨基)嘧啶-4-基氨基)-2H-苯并[b][1,4]噁嗪-4(3H)-基)丙-2-烯-1-酮I-194
根据下文所述的方案、步骤和中间物制备标题化合物。
A)2，DIPEA，THF，回流；B)4，HOAc，叔戊醇，回流，12小时；C)TFA，DCM；D)7，DIPEA，DCM，NMP，-10℃。
步骤1
将1(186mg，1.1mmoL)、2(280mg，1.1mmoL)和汉尼格氏碱(220μL，1.3mmoL)溶解于THF(6mL)中。在回流下加热反应混合物过夜。冷却后，使其在水/盐水(6mL)之间分配，搅动并分离各层。用硫酸钠干燥有机相，并经由旋转蒸发去除溶剂，得到茶色固体。LC/MS(RT＝3.008/(M+1))381.1。
步骤2
将3(215mg，0.56mmoL)和4(83mg，0.66mmoL)悬浮于叔戊醇(6mL)和乙酸(3滴)中。加热到回流，保持12小时。冷却后，经由旋转蒸发去除溶剂。使深色油状物在水/盐水与EtOAc(各5mL)之间分配，搅动，并分离各层，并且用硫酸钠干燥有机相。经由旋转蒸发去除溶剂，得到油状物。在combiflash系统上使用30％到70％的庚烷/乙酸乙酯梯度进行快速色谱分离，得到茶色固体。LC/MS(RT＝2.011/(M+1))469.2。
步骤3
向5(200mg，0.43mmol)于DCM(10mL)中的溶液中添加TFA(1mL)。搅拌30分钟，在室温下搅拌12小时；经由旋转蒸发去除溶剂，并使油状物在冷的(0℃)饱和碳酸氢钠(5mL)与EtOAc(5mL)之间分配，搅动并分离各层。用硫酸钠干燥有机相，并经由旋转蒸发去除溶剂，得到粉红色固体。LC/MS(RT＝2.782/(M+1))369.1。
步骤4
在水/冰甲醇浴(-10℃)中冷却6(150mg，0.41mmol)于DCM(2mL)和NMP(0.5mL)中的溶液。向此溶液中添加7(34μL，0.43mmoL)，搅拌10分钟，随后添加汉尼格氏碱(70μL，0.43mmoL)，并搅拌10分钟。使其在水/盐水(5mL)之间分配，搅动并分离各层。用硫酸钠干燥有机相。经由快速色谱法，使用20％到80％的庚烷/乙酸乙酯梯度直接纯化，得到粉红色固体。LC/MS(RT＝2.8/(M+H))423.1。
实例32
制备1-(6-(5-氟-2-(4-(2-甲氧基乙氧基)苯基氨基)嘧啶-4-基氨基)-2H-苯并[b][1,4]噁嗪-4(3H)-基)丙-2-烯-1-酮I-141
根据实例31中所述的方案、步骤和中间物，在步骤2中使用4-(2-甲氧基乙氧基)苯胺代替4，来制备标题化合物。LC/MS(RT＝2.845/(M+H))466.2。
实例33
制备1-(6-(5-氟-2-(6-甲氧基吡啶-3-基氨基)嘧啶-4-基氨基)吲哚啉-1-基)丙-2-烯-1-酮I-166
根据实例31中所述的方案、步骤和中间物，在步骤1中使用6-氨基吲哚啉-1-甲酸叔丁酯代替2，来制备标题化合物。LC/MS(RT＝2.825/(M+H))407.1。
实例34
制备1-(5-(5-氟-2-(6-甲氧基吡啶-3-基氨基)嘧啶-4-基氨基)异吲哚啉-2-基)丙-2-烯-1-酮I-165
根据实例31中所述的方案、步骤和中间物，在步骤1中使用5-氨基异吲哚啉-1-甲酸叔丁酯代替2，来制备标题化合物。LC/MS(RT＝2.751/(M+H))407.1。
实例35
制备1-(6-(4-(3-氯苯基氨基)-5-氟嘧啶-2-基氨基)-2H-苯并[b][1,4]噁嗪-4(3H)-基)丙-2-烯-1-酮I-149
根据下文所述的方案、步骤和中间物制备标题化合物。
A)2，DIPEA，THF，回流；B)4，HOAc，叔戊醇，回流，12小时；C)TFA，DCM；D)7，DIPEA，THF，-10℃。
步骤1
将1(484mg，2.9mmoL)、2(305mg，2.9mmoL)和汉尼格氏碱(526μL，3.5mmoL)溶解于THF(10mL)中。在回流下加热反应混合物过夜。冷却后，使其在水/盐水(10mL)之间分配，搅动并分离各层。用硫酸钠干燥有机相，并经由旋转蒸发去除溶剂。在combiflash系统上使用0-30％的庚烷/乙酸乙酯梯度进行快速色谱分离，得到白色固体。LC/MS(RT＝2.03/(M+1))339.1。
步骤2
将3(150mg，0.58mmoL)和4(175mg，0.7mmoL)悬浮于叔戊醇(8mL)和乙酸(3滴)中。加热到回流，保持12小时。冷却后，经由旋转蒸发去除溶剂。使深色油状物在水/盐水与EtOAc(各5mL)之间分配，搅动，并分离各层，并且用硫酸钠干燥有机相。经由旋转蒸发去除溶剂，得到深色油状物。在combiflash系统上使用0到25％的庚烷/乙酸乙酯梯度进行快速色谱分离，得到白色固体。LC/MS(RT＝2.997/(M+1))470.2。
步骤3
向5(180mg，0.38mmol)于DCM(10mL)中的溶液中添加TFA(1mL)。搅拌30分钟，在室温下搅拌4小时；经由旋转蒸发去除溶剂，并使油状物在冷的(0℃)饱和碳酸氢钠(5mL)与EtOAc(5mL)之间分配，搅动并分离各层。用硫酸钠干燥有机相，并经由旋转蒸发去除溶剂，得到浅黄色固体。LC/MS(RT＝2.723/(M+1))423.1。
步骤4
在水/冰甲醇浴(-10℃)中冷却6(150mg，0.4mmol)于THF(3mL)中的溶液。向此溶液中添加7(34μL，0.42mmoL)，搅拌10分钟，随后添加汉尼格氏碱(70μL，0.42mmoL)，并搅拌10分钟。使其在水/盐水(5mL)之间分配，搅动并分离各层。用硫酸钠干燥有机相。经由旋转蒸发去除溶剂，得到浅黄色固体。在combiflash系统上使用10％到50％的庚烷/乙酸乙酯梯度进行快速色谱分离，得到白色固体。LC/MS(RT＝2.945/(M+H))426。
实例36
制备5-(2-(4-丙烯酰基-3,4-二氢-2H-苯并[b][1,4]噁嗪-6-基氨基)-5-氟嘧啶-4-基氨基)吲哚啉-2-酮I-130
根据实例35中所述的方案、步骤和中间物，在步骤1中使用5-氨基吲哚啉-2-酮代替2，来制备标题化合物。LC/MS(RT＝2.673/(M+H))447.1。
实例37
制备4-(3-丙烯酰胺基苯基氨基)-2-(苯基氨基)嘧啶-5-甲酰胺I-230
根据下文所述的方案、步骤和中间物制备标题化合物。
A)2，NEt3，DCM，0℃到室温；B)4，DIPEA，THF，室温，12小时；C)6，DIPEA，叔戊醇，回流，4小时；D)TFA，DCM，室温；E)7，NEt3，THF，0℃；F)TFA，TfOH，DCM，室温。
步骤1
将1(500mg，2.4mmoL，根据药物化学杂志(J.Med.Chem.)50:591(2007)和US2007/0072851，由2,4-二羟基嘧啶-5-甲酸制备)溶解于DCM(10mL)中，并在冰/水浴(0℃)中冷却。添加2(309μL，2.4mmoL)，并搅拌混合物10分钟。添加三乙胺(365μL，2.6mmol)，并使混合物升温到室温，且搅拌30分钟。经由旋转蒸发缩减溶剂的体积，并借助快速色谱法，在combiflash系统上使用0到30％的庚烷/乙酸乙酯梯度直接纯化，得到白色固体。LC/MS(RT＝2.789/(M+1))312。
步骤2
将3(170mg，0.55mmoL)、4(113mg，0.55mmoL)和汉尼格氏碱(108μL，0.65mmoL)溶解于THF(6mL)中。在室温下搅拌12小时。使其在水/盐水之间进行分配，搅动，并分离各层，且用硫酸钠干燥有机相。经由旋转蒸发去除溶剂，用EtOAc滴定，而后得到白色固体。LC/MS(RT＝3.123/(M+1))484。
步骤3
将5(230mg，0.48mmol)、6(126μL，1.4mmoL)和汉尼格氏碱(94μL，0.57mmoL)溶解于叔戊醇(6mL)中。加热到回流，保持4小时，冷却并将水添加到固体物质中。搅动，过滤并干燥，得到白色固体。LC/MS(RT＝3.182/(M+1))541.2。
步骤4
将7(180mg，0.33mmol)悬浮于DCM(10mL)中，并用TFA(1mL)处理。在室温下搅拌过夜。用DCM(40mL)稀释，并用NaOH(1N，25mL)洗涤。搅动，形成沉淀物，过滤并干燥，得到白色固体。LC/MS(RT＝2.934/(M+1))441.1。
步骤5
在水/冰(0℃)中冷却8(130mg，0.29mmol)于THF(6mL)中的悬浮液。向其中添加9(25μL(再加5μL)，0.38mmoL(总计))，随后添加三乙胺(43μL(再加11μL)，0.38mmoL(总计))，并搅拌总计1小时时间。添加水，搅动，滤出残留沉淀物，并丢弃。用硫酸钠干燥滤液。经由旋转蒸发去除溶剂，得到黄色固体。在combiflash系统上使用0到25％的庚烷/乙酸乙酯梯度进行快速色谱分离，得到白色固体。LC/MS(RT＝2.964/(M+H))495.1。
步骤6
向I-231(30mg，0.061mmol)于DCM(4mL)中的悬浮液中添加TFA(200μL)和三氟甲磺酸(68μL，0.61mmoL)。在室温下搅拌1小时。在减压下经由旋转蒸发去除溶剂，并使其在冷的(0℃)饱和碳酸氢钠(10mL)与EtOAc(10mL)之间分配，搅动并分离各层。用硫酸钠干燥有机层，并经由旋转蒸发去除溶剂，用乙醚滴定，而后得到白色固体。LC/MS(RT＝2.715/(M+H))375.1。
实例38
制备4-(3-丙烯酰胺基苯基氨基)-N-苯基-2-(苯基氨基)嘧啶-5-甲酰胺I-222
根据实例37中所述的方案、步骤和中间物，在步骤1中使用苯胺代替2并省略步骤6，来制备标题化合物。LC/MS(RT＝2.991/(M+H))451.2。
实例39
制备4-(3-丙烯酰胺基苯基氨基)-N-环丙基-2-(苯基氨基)嘧啶-5-甲酰胺I-221
根据实例37中所述的方案、步骤和中间物，在步骤1中使用环丙胺代替2并省略步骤6，来制备标题化合物。LC/MS(RT＝2.838/(M+H))415.2。
实例40
制备4-(3-丙烯酰胺基苯基氨基)-2-(3-甲氧基苯基氨基)嘧啶-5-甲酰胺I-210
根据实例37中所述的方案、步骤和中间物，在步骤3中使用3-甲氧基苯胺代替6，来制备标题化合物。LC/MS(RT＝2.743/(M+H))405.1。
实例41
制备4-(3-丙烯酰胺基苯基氨基)-2-(6-甲氧基吡啶-3-基氨基)嘧啶-5-甲酰胺I-209
根据实例37中所述的方案、步骤和中间物，在步骤3中使用6-甲氧基吡啶-3-胺代替6，来制备标题化合物。LC/MS(RT＝2.657/(M+H))406.2。
实例42
制备1-{6-[5-乙酰基-2-(6-甲氧基-吡啶-3-基氨基)-嘧啶-4-基氨基]-2,3-二氢-苯并[1,4]噁嗪-4-基}-丙烯酮I-170
根据下文所述的方案、步骤和中间物制备标题化合物。
A)2，DIPEA，THF，70℃，16小时；B)(a)4，PdCl2(PPh3)2，DMF，70℃；(b)1N HCl，丙酮，60℃，15分钟；C)HCl/二噁烷，DCM；D)7，DIPEA，NMP，DCM，-20℃到室温；E)9，pTsOH，二噁烷，100℃，15分钟。
步骤1
在70℃下，将499mg 1(2.19mmol)、547mg 2(2.19mmol)和500μL N,N-二异丙基乙胺于20mL无水四氢呋喃中的混合物加热过夜。冷却后，浓缩反应混合物，并用50mL EtOAc、20mL碳酸氢钠溶液、盐水进行水性处理，并用无水硫酸钠干燥。过滤并浓缩后，使残余物通过短二氧化硅滤筒，用庚烷/EtOAc(体积比3/1)洗脱，得到815mg略带黄色的固体(84％)。LC-MS:m/z 441.0(ES+),439.0(ES-)。
步骤2
用氮气净化中间物3(815mg，1.85mmol)、4(740mg，1.1当量)、27mg二氯双(三苯基膦)钯(II)(2mol％)于6mL无水DMF中的混合物30分钟。随后在70℃下加热反应混合物过夜。LC-MS显示70％转化。冷却后，添加30mL乙酸乙酯以及含760mg氟化钾的5mL水，并在室温下搅拌混合物至少2小时。滤出白色沉淀物，并分离有机层，用水、盐水洗涤，并且用无水硫酸钠干燥。
过滤并浓缩后，将残余物溶解于20mL丙酮中，随后添加3mL 1.0N盐酸水溶液。在60℃下加热混合物15分钟，并在减压下浓缩。使用50mL EtOAc、10mL饱和碳酸氢钠溶液、盐水、无水硫酸钠进行常规处理。浓缩后，借助硅胶快速管柱色谱法纯化残余物，得到405mg黄色固体(以消耗的原料计，70％)，还回收到183mg中间物3。LC-MS:m/z 405.1(ES+),403.1(ES-)。
步骤3
向1.28g中间物I-2于10mL二氯甲烷中的混合物中添加10mL 4.0N HCl的二噁烷溶液。在室温下搅拌过夜，去除溶剂，并在真空中干燥残余物。LC-MS:m/z 305.1(ES+),303.1(ES-)。
步骤4
在-20℃下，于氮气下向上文获得的中间物6、1mL DIPEA于10mL NMP和10mL二氯甲烷中的混合物中添加275μL 7(1.1当量)。持续反应5分钟，随后用1mL异丙醇淬灭。使反应混合物升温到室温，并用100mL EtOAc萃取，用水(2次，每次10mL)、盐水洗涤，用硫酸钠干燥。过滤并浓缩后，借助快速管柱色谱法，利用洗脱剂庚烷/EtOAc(体积比2/3)纯化残余物，得到450mg(40％)黄色固体I-3。LC-MS:m/z 359.1(ES+),357.1(ES-)。
步骤5
在100℃下，将30mg中间物8(84μmol)和13mg 9(1.2当量)于1mL 0.08M p-TsOH二噁烷溶液中的混合物加热15分钟。冷却后，用50mL EtOAc、碳酸氢钠水溶液、盐水对反应混合物进行常规处理，并用无水硫酸钠干燥。浓缩后，借助硅胶管柱色谱法，利用庚烷/EtOAc(体积比1/4)作为洗脱剂纯化残余物，得到22.8mg苍白色固体(61％)。LC-MS:m/z＝447.1(ES+),445.2(ES-)。
实例43
制备1-{6-[5-乙酰基-2-(4-吗啉-4-基-苯基氨基)-嘧啶-4-基氨基]-2,3-二氢-苯并[1,4]噁嗪-4-基}-丙烯酮I-169
根据实例42中所述的方案、步骤和中间物，在步骤5中使用4-吗啉-4-基-苯胺代替9，来制备标题化合物。LC-MS:m/z 501.1(ES+),499.2(ES-)。
实例44
制备1-{6-[5-乙酰基-2-(6-吗啉-4-基-吡啶-3-基氨基)-嘧啶-4-基氨基]-2,3-二氢-苯并[1,4]噁嗪-4-基}-丙烯酮I-168
根据实例42中所述的方案、步骤和中间物，在步骤5中使用3-氨基-[6-吗啉-4-基]-吡啶代替9，来制备标题化合物。LC-MS:m/z 502.2(ES+),500.3(ES-)。
实例45
制备1-{6-[5-乙酰基-2-(1-甲基-1H-吲唑-6-基氨基)-嘧啶-4-基氨基]-2,3-二氢-苯并[1,4]噁嗪-4-基}-丙烯酮I-154
根据实例42中所述的方案、步骤和中间物，在步骤5中使用1-甲基-1H-吲唑-6-基胺代替9，来制备标题化合物。LC-MS:m/z 470.1(ES+),468.1(ES-)。
实例46
制备1-{6-[5-乙酰基-2-(1H-吲唑-6-基氨基)-嘧啶-4-基氨基]-2,3-二氢-苯并[1,4]噁嗪-4-基}-丙烯酮I-153
根据实例42中所述的方案、步骤和中间物，在步骤5中使用1H-吲唑-6-基胺代替9，来制备标题化合物。LC-MS:m/z 456.1(ES+),454.2(ES-)。
实例47
制备1-{4-[5-乙酰基-4-(4-丙烯酰基-3,4-二氢-2H-苯并[1,4]噁嗪-6-基氨基)-嘧啶-2-基氨基]-苯基}-吡咯烷-2-酮I-152
根据实例42中所述的方案、步骤和中间物，在步骤5中使用1-(4-氨基-苯基)-吡咯烷-2-酮代替9，来制备标题化合物。LC-MS:m/z 456.1(ES+),454.2(ES-)。
实例48
制备1-(6-{5-乙酰基-2-[4-(2-甲氧基-乙氧基)-苯基氨基]-嘧啶-4-基氨基}-2,3-二氢-苯并[1,4]噁嗪-4-基)-丙烯酮I-150
根据实例42中所述的方案、步骤和中间物，在步骤5中使用4-(2-甲氧基-乙氧基)-苯胺代替9，来制备标题化合物。LC-MS:m/z 490.2(ES+),488.3(ES-)。
实例49
制备5-[5-乙酰基-4-(4-丙烯酰基-3,4-二氢-2H-苯并[1,4]噁嗪-6-基氨基)-嘧啶-2-基氨基]-1,3-二氢-吲哚-2-酮I-129
根据实例42中所述的方案、步骤和中间物，在步骤5中使用5-氨基-1,3-二氢-吲哚-2-酮代替9，来制备标题化合物。LC-MS:m/z 471.1(ES+),469.2(ES-)。
实例50
制备1-(6-{5-乙酰基-2-[6-(2-羟基-乙氧基)-吡啶-3-基氨基]-嘧啶-4-基氨基}-2,3-二氢-苯并[1,4]噁嗪-4-基)-丙烯酮I-128
根据实例42中所述的方案、步骤和中间物，在步骤5中使用2-(5-氨基-吡啶-2-基氧基)-乙醇代替9，来制备标题化合物。LC-MS:m/z 477.1(ES+),475.2(ES-)。
实例51
制备N-{3-[5-乙酰基-2-(6-甲氧基-吡啶-3-基氨基)-嘧啶-4-基氨基]-苯基}-丙烯酰胺I-189
根据实例42中所述的方案、步骤和中间物，在步骤1中使用3-氨基苯基氨基甲酸叔丁酯代替2，并在步骤5中使用5-氨基-2-甲氧基吡啶代替9，来制备标题化合物。LC-MS:m/z405.1(ES+),403.2(ES-)。
实例52
制备N-{3-[5-乙酰基-2-(6-甲氧基-吡啶-3-基氨基)-嘧啶-4-基氧基]-苯基}-丙烯酰胺I-188
根据实例42中所述的方案、步骤和中间物，在步骤1中使用3-羟基苯基氨基甲酸叔丁酯代替2，并在步骤5中使用5-氨基-2-甲氧基吡啶代替9，来制备标题化合物。LC-MS:m/z406.2(ES+),404.1(ES-)。
实例53
制备1-{3-[5-乙酰基-2-(6-甲氧基-吡啶-3-基氨基)-嘧啶-4-基氨基]-氮杂环丁-1-基}-丙烯酮I-187
根据实例42中所述的方案、步骤和中间物，在步骤1中使用3-氨基-N-Boc-氮杂环丁烷代替2，并在步骤5中使用5-氨基-2-甲氧基吡啶代替9，来制备标题化合物。LC-MS:m/z369.1(ES+),367.2(ES-)。
实例54
制备N-(3-{5-乙酰基-2-[4-(2-甲氧基-乙氧基)-苯基氨基]-嘧啶-4-基氨基}-苯基)-丙烯酰胺I-124
根据实例42中所述的方案、步骤和中间物，在步骤1中使用3-氨基苯基氨基甲酸叔丁酯代替2，并在步骤5中使用4-(2-甲氧基-乙氧基)-苯胺代替9，来制备标题化合物。LC-MS:m/z 448.2(ES+),446.3(ES-)。
实例55
制备N-(3-{5-乙酰基-2-[6-(2-甲氧基-乙氧基)-吡啶-3-基氨基]-嘧啶-4-基氨基}-苯基)-丙烯酰胺I-122
根据实例42中所述的方案、步骤和中间物，在步骤1中使用3-氨基苯基氨基甲酸叔丁酯代替2，并在步骤5中使用6-(2-甲氧基-乙氧基)-吡啶-3-基胺代替9，来制备标题化合物。LC-MS:m/z 449.2(ES+),447.1(ES-)。
实例56
制备N-(3-{5-乙酰基-2-[6-(2-羟基-乙氧基)-吡啶-3-基氨基]-嘧啶-4-基氨基}-苯基)-丙烯酰胺I-121
根据实例42中所述的方案、步骤和中间物，在步骤1中使用3-氨基苯基氨基甲酸叔丁酯代替2，并在步骤5中使用2-(5-氨基-吡啶-2-基氧基)-乙醇代替9，来制备标题化合物。LC-MS:m/z 435.1(ES+),433.2(ES-)。
实例57
制备4-(3-丙烯酰胺基苯氧基)-2-(3-甲氧基苯基氨基)-嘧啶-5-甲酸苯基酰胺I-200
根据下文所述的方案、步骤和中间物制备标题化合物。
A)2，NaH，THF，0℃；B)NaOH，THF，MeOH；C)5，TBTU，DIPEA，CH3CN，0℃；D)MCPBA，CH2Cl2，0℃；E)8，50℃，3小时；F)TFA，CH2Cl2；G)11，DIPEA，CH2Cl2
步骤1
在0℃下，向经搅拌的(3-羟基苯基)氨基甲酸叔丁酯2(1.79g，8.59mmol)的溶液中添加氢化钠(60％于矿物油中的分散液)(0.34g，8.9mmol)于无水THF(30mL)中的悬浮液。在0℃下搅拌混合物20分钟。随后，在0℃下将苯氧化物溶液逐滴添加到4-氯-(2-甲硫基)嘧啶-5-甲酸乙酯1(2g，8.59mmol)于THF(20mL)中的溶液中。在0℃下搅拌反应混合物2小时。用乙酸乙酯(150mL)稀释反应混合物并依次用水(50mL)和盐水(50mL)洗涤。用硫酸钠干燥有机层，过滤并且在真空中浓缩。用CH2Cl2:己烷(1:9)洗涤粗产物，得到白色固体状的标题化合物3(2.43g，70％)。
步骤2
在-10℃下，向经搅拌的4-(3-叔丁氧羰基氨基苯氧基)-2-(甲硫基-嘧啶)-5-甲酸乙酯3(2g，4.93mmol)于THF(60mL)中的溶液中添加甲醇(60mL)，随后添加氢氧化钠水溶液(0.3g，30mL水，7.5mmol)。使反应混合物升温到室温，并搅拌1小时。用水(50mL)稀释反应混合物，用柠檬酸酸化，并借助过滤来收集所得固体，且用冰冷的水(50mL)洗涤，得到白色固体状的4。(1.52g，82％)。
步骤3
在0℃下，向经搅拌的4-(3-叔丁氧羰基氨基苯氧基)-2-(甲硫基)嘧啶-5-甲酸4(2.0g，5.29mmol)和TBTU(2.55g，7.94mmol)于乙腈(30mL)中的溶液中依次添加DIPEA(1.36g，10.6mmol)和苯胺5(0.60g，6.35mmol)。在室温下搅拌反应物2小时。反应完成后，将反应混合物倒入冰冷的水(100mL)中，并借助过滤来收集所得白色固体，并且用冰冷的水(20mL)洗涤，在真空中干燥，得到标题化合物6(1.79g，75％)。
步骤4
在0℃下，向经搅拌的[3-(2-甲硫基-5-苯基氨甲酰基嘧啶-4-基氧基)-苯基]-氨基甲酸叔丁酯6(1.5g，3.31mmol)于CH2Cl2中的溶液中添加m-CPBA(70％，1.62g，2eq)于CH2Cl2(10mL)中的溶液。使反应混合物升温到室温，并搅拌12小时。用饱和NaHCO3水溶液淬灭反应，并用EtOAc萃取整个溶液。用盐水洗涤有机层，用Na2SO4干燥，过滤并在真空中浓缩。用CH2Cl2:己烷(1:9)洗涤粗产物，得到白色固体状的标题化合物7(1.16g，73％)。
步骤5
将过量的3-甲氧基苯胺(8)(2mL)添加到固体[3-(2-甲烷磺酰基-5-苯基氨甲酰基-嘧啶-4-基氧基)-苯基]-氨基甲酸叔丁酯7(0.5g，1.03mmol)中，并在氩气氛围下，将所得混合物加热到50℃，保持3小时。将反应混合物冷却到室温，并用乙酸乙酯/己烷(1:1，20mL)稀释，过滤所得沉淀物并用乙酸乙酯/己烷(1:1，10mL)洗涤，得到白色固体状的所需产物9(0.40g，产率75％)。
步骤6
向{3-[2-(3-甲氧基-苯基氨基)-5-苯基氨甲酰基-嘧啶-4-基氧基]-苯基}-氨基甲酸叔丁酯9(0.3g，0.56mmol)于CH2Cl2(10mL)中的溶液中添加三氟乙酸(2mL)，并在室温下搅拌混合物1小时。在减压下去除溶剂，并将残余物溶解于CH2Cl2中，用10％NaHCO3水溶液洗涤，干燥(Na2SO4)，过滤并在减压下蒸发，得到白色固体状的自由胺10。
步骤7
在氩气氛围下，向冷却到-70℃的经搅拌的胺10(0.24g，0.56mmol)于二氯甲烷(20mL)中的溶液中添加DIPEA(0.072g，0.56mmol)，随后逐滴添加丙烯酰氯(0.050g，0.56mmol)。在-70℃下搅拌所得混合物5分钟，并用CH2Cl2(50mL)稀释反应混合物，随后用饱和NaCl水溶液(10mL)洗涤。干燥(Na2SO4)有机层，过滤并在减压下蒸发。借助硅胶快速色谱法，使用(MeOH-CHCl3 5:95)作为洗脱剂纯化残余物，得到白色固体状的目标化合物11(0.094g，35％)：1H NMR(200MHz,DMF-d7)δ8.9(s,1H),8.10-7.70(m,6H),7.60-7.10(m,6H),6.60(m,2H)6.40(dd,1H,J＝8.0,2.0Hz),5.80(m,2H),3.70(s,3H)。
实例58
制备4-(3-丙烯酰胺基苯氧基)-2-(6-甲氧基吡啶-3-基氨基)-嘧啶-5-甲酸苯基酰胺I-159
根据实例57中所述的方案、步骤和中间物，在步骤5中使用6-甲氧基-3-氨基吡啶代替8，来制备标题化合物。1H NMR(200MHz,DMSO-d6δ8.90(s,1H),8.20(brs,1H),7.90-7.60(m,4H),7.45(m,4H),7.10(m,2H),6.50(m,1H),6.20(m,2H),5.90(dd,J＝8.0,2.0Hz,1H),3.90(s,3H)。
实例59
制备4-(3-丙烯酰胺基苯氧基)-2-(3-甲氧基苯基氨基)-嘧啶-5-甲酸环丙基酰胺I-177
根据实例57中所述的方案、步骤和中间物，在步骤3中使用环丙胺代替5，来制备标题化合物。1H NMR(200MHz,CD3OD)δ9.0(s,1H),7.90(brs,1H),7.50(m,3H),7.0(m,4H),6.50(m,1H),6.40(d,J＝8.0Hz,2H),5.80(dd,J＝8.2,3.0Hz,1H),3.60(s,3H),0.90(m,2H),0.62(m,2H)。
实例60
制备4-(3-丙烯酰胺基苯氧基)-2-(6-甲氧基吡啶-3-基氨基)-嘧啶-5-甲酸环丙基酰胺I-176
根据实例57中所述的方案、步骤和中间物，在步骤3中使用环丙胺代替5，并在步骤5中使用6-甲氧基-3-氨基吡啶代替8，来制备标题化合物。1H NMR(200MHz,CD3OD)δ8.90(s,1H),7.95(brs,1H),7.90-7.82(m,3H),7.40(m,3H),6.98(d,J＝6.0Hz,1H),6.42(m,2H),5.90(dd,J＝8.0,2.0Hz,1H),3.90(s,3H),0.95(m,2H),0.83(m,2H)。
实例61
制备4-(3-丙烯酰胺基苯氧基)-2-(3-甲氧基苯基氨基)嘧啶-5-甲酸酰胺I-178
根据下文所述的方案、步骤和中间物制备标题化合物。
A)2，NaH，THF，0℃；B)LiOH，THF，H2O；C)5，TBTU，DIPEA，CH3CN；D)MCPBA，CHCl3，0℃；E)8，DMA，90℃，24小时；F)4N HCl，二噁烷；G)11，CH2Cl2；H)三氟甲磺酸，TFA，CH2Cl2
步骤1
步骤1是以类似于实例57中步骤1的方式进行。
步骤2
利用含LiOH(500mg，20mmol)的80mL THF/H2O(1:1)对3(4.58g，11.3mmol)进行皂化，并用1N HCl进行常规处理，得到自由酸4。
步骤3
在室温下，将酸4与含4-甲氧基苯甲胺(1.55g，11.3mmol)、TBTU(5.4g，16.8mmol)和DIEA(2.4mL，13.4mmol)的100mL MeCN直接混合。使反应混合物反应过夜，进行快速色谱分离(EtOAc-己烷)，而后得到白色固体状的6(4.2g，8.5mmol)。
步骤4
步骤4是以类似于实例57中步骤4的方式，用CHCl3取代CH2Cl2作为溶剂来执行。
步骤5
将7的2-甲基砜(1.0g，1.9mmol)与3-甲氧基苯胺(420mg，3.4mmol)混合于DMA中，并在90℃下加热混合物24小时。以类似于实例57中步骤5的方式进行处理，得到9(300mg，0.52mmol)。
步骤6、7和8
通过用4N HCl的二噁烷溶液处理，去除9中的Boc基团。在-40℃下，立即用含丙烯酰氯(43μL，0.52mmol)的15mL DCM处理产物(300mg，0.52mmol)。借助快速色谱法(MeOH-DCM)纯化此中间物，并使其与三氟甲磺酸和TFA在DCM中反应，得到粗苯甲胺11(120mg，0.228mmol)。在室温下，使用含三氟甲磺酸(305μL，3.44mmol)的TFA/DCM(5mL，1:1)将此中间物(120mg，0.228mmol)转化成I-178，经由管柱色谱法纯化，而后得到约35mg灰色粉末状的最终化合物I-178(3个步骤产率16％)。MS:m/z＝405。
实例62
制备3-(3-(4-(3-丙烯酰胺基苯基氨基)-5-甲基嘧啶-2-基氨基)苯氧基)丙基氨基甲酸叔丁酯I-45
根据下文所述的方案、步骤和中间物制备标题化合物。
A)1，甲烷磺酰氯，CH2Cl2，Et3N，室温，1小时；B)3，K2CO3，DMF，60℃；C)H2，Pd/C，EtOH，室温，16小时；D)6，7，Pd(OAc)2，BINAP，Cs2CO3，甲苯，100℃，16小时；E)5，AcOH，EtOH，90℃，16小时；F)H2，Pd/C，EtOH，室温，16小时；G)11，NMP，0℃，15分钟
步骤1
向经搅拌的1(1.0g，5.7mmol)于二氯甲烷(20.0mL)中的溶液中添加Et3N(1.15g，11.41mmol)和甲烷磺酰氯(0.98g，8.56mmol)。在室温下，于氮气氛围下搅拌反应混合物60分钟。用水(20mL)淬灭反应混合物，并用EtOAc萃取2次，每次50mL。用10％NaHCO3溶液(25mL)、水(25mL)、盐水(25mL)洗涤合并的EtOAc萃取物，用Na2SO4干燥并在减压下浓缩，得到无色粘稠液体状的2(1.36g，94％)。其不经进一步纯化即用于下一步骤中。
步骤2
向经搅拌的2(0.749g，5.39mmol)和K2CO3(0.99g，7.19mmol)于无水DMF(20mL)中的溶液中添加3(1.36g，5.39mmol)，并在60℃下，于氮气氛围下加热反应混合物16小时。冷却反应混合物，在减压下浓缩并将残余物溶解于乙酸乙酯(25mL)中。用水(2次，每次10mL)、盐水(10mL)洗涤乙酸乙酯溶液，用Na2SO4干燥，并在减压下浓缩，得到微黄色粘稠液体状的4(1.2g，75％)。其不经进一步纯化即用于下一步骤中。
步骤3
向4(1.20g，4.05mmol)于乙醇(25mL)中的溶液中添加Pd/C(0.12g，以重量比计10％)，并在室温下，于氢气氛围(1.5Kg氢气压力)下搅拌反应混合物16小时。反应混合物经垫过滤，并在减压下浓缩，得到微褐色粘稠油状的5(0.95g，88％)。其不经进一步纯化即用于下一步骤中。
步骤4
向6(1.69g，12.26mmol)于甲苯(50.0mL)中的溶液中添加7(2.0g，12.26mmol)、BINAP(0.3g，0.49mmol)、碳酸铯(7.9g，24.5mmol)。使溶液脱气(通过用氮气净化15分钟)，并向其中添加Pd(OAc)2(0.054g，0.25mmol)。在100℃下，于氮气氛围下搅拌反应混合物16小时。将其冷却，用乙酸乙酯(100mL)稀释，并经过滤。用水(2次，每次25mL)、盐水(25mL)洗涤滤液，用Na2SO4干燥并在减压下浓缩。借助管柱色谱法(SiO2，60-120目，乙酸乙酯/己烷：15/85)进一步纯化得到的残余物。用乙醚洗涤蒸发所需洗脱部分后得到的固体，并在高真空下干燥，得到浅黄色固体状的8(1.2g，37％)。
步骤5
向8(0.5g，1.89mmol)和5(0.805g，3.0mmol)于乙醇(10.0mL)中的溶液中添加冰乙酸(0.056g，0.95mmol)，并在密封管中，于90℃下搅拌反应混合物16小时。冷却反应混合物，在减压下浓缩。用10％碳酸氢钠溶液(10.0mL)淬灭残余物，并用乙酸乙酯萃取3次，每次15mL。用水(15mL)、盐水(15mL)洗涤合并的乙酸乙酯萃取物，用Na2SO4干燥并在减压下浓缩，得到残余物。借助管柱色谱法(SiO2，EtOAc/己烷：50/50)进一步纯化粗残余物，得到浅黄色固体状的9(0.57g，61％)。
步骤6
向9(0.56g，1.13mmol)于乙醇(25mL)中的溶液中添加10％Pd/C(0.068g)，并在室温下，于氢气氛围(1.5Kg氢气压力)下搅拌反应混合物16小时。反应混合物经垫过滤，并在减压下浓缩，得到微褐色固体状的10(0.45g，85％)。其不经进一步纯化即用于下一步骤中。
步骤7
在0℃下，向经搅拌的10(0.25g，0.5382mmol)于NMP(2.5mL)中的溶液中添加丙烯酰氯(0.073g，0.807mmol)，并在0℃下搅拌反应混合物15分钟。将反应混合物逐滴添加到搅拌的冷10％NaHCO3溶液中。添加完成后，在0℃下再搅拌溶液30分钟，随后经布氏漏斗(Buchner funnel)过滤，分离出沉淀的固体。用冷水和己烷洗涤固体。将其溶解于甲醇:二氯甲烷(50:50，10mL)中，并在减压下浓缩。将得到的残余物悬浮于冷水(50mL)中，向其中添加Et3N，并用乙酸乙酯萃取2次，每次100mL。用水(50mL)、盐水(50mL)洗涤合并的乙酸乙酯萃取物，用Na2SO4干燥并在减压下浓缩，得到灰白色固体状的残余物I-45(0.100g，35.8％)。1H NMR(DMSO-d6)δppm:1.37(s,9H),1.70-1.80(m,2H),2.10(s,3H),3.00-3.06(m,2H),3.79(t,J＝6.24Hz,2H),5.74(d,J＝11.92Hz,1H),6.24(dd,J＝1.84&15.16Hz,1H),6.35-6.47(m,2H),6.80-6.90(bs,1H),6.97(t,J＝8.28Hz,1H),7.23-7.27(m,2H),7.31(s,1H),7.37(d,J＝8.2Hz,1H),7.46(d,J＝7.48Hz,1H),7.90-7.90-7.91(m,2H),8.36(s,1H),8.87(s,1H),10.07(s,1H)；LCMS:m/e 519(M+1)。
实例63
制备3-(3-(4-(3-丙烯酰胺基苯基氨基)-5-氟嘧啶-2-基氨基)苯氧基)丙基氨基甲酸叔丁酯I-183
根据下文所述的方案、步骤和中间物制备标题化合物。
A)甲烷磺酰氯，CH2Cl2，Et3N，室温，1小时；B)K2CO3，DMF，60℃，16小时；C)Pd-C，H2，乙醇，室温，16小时。
步骤1'
向经搅拌的2'(4.0g，22.8mmol)于二氯甲烷(80.0mL)中的溶液中添加Et3N(4.6g，45.5mmol)和甲烷磺酰氯(3.92g，34.2mmol)，并在室温下，于氮气氛围下搅拌反应混合物60分钟。用水(50mL)淬灭反应，并用EtOAc萃取2次，每次100mL。用10％NaHCO3溶液(50mL)、水(50mL)和盐水(50mL)洗涤合并的萃取物，用Na2SO4干燥并在减压下浓缩，得到浅黄色粘稠液体状的2(5.5g，95.2％)。化合物2不经进一步纯化即用于下一步骤中。
步骤2'
向经搅拌的1(2.3g，16.5mmol)和K2CO3(4.6g，33.3mmol)于无水DMF(100mL)中的溶液中添加2(5.5g，21.7mmol)，并在60℃下，于氮气氛围下加热反应混合物16小时。冷却反应物，用水(250ml)淬灭，并用EtOAc萃取2次，每次100mL。用10％NaHCO3溶液(100mL)、水(3次，每次100mL)和盐水(100mL)洗涤合并的萃取物，用Na2SO4干燥并在减压下浓缩，得到浅黄色粘稠液体状的3(4.0g，81.6％)。化合物3不经进一步纯化即用于下一步骤中。
步骤3'
向3(4.0g，13.4mmol)于乙醇(50mL)中的溶液中添加Pd/C(0.8g，以重量比计10％)，并在室温下，于氢气氛围(1.5Kg氢气压力)下搅拌反应混合物16小时。反应混合物经垫过滤，并在减压下浓缩，得到微褐色粘稠油状的4(3.3g，91.9％)。化合物4不经进一步纯化即用于下一步骤中。
步骤1
向压力管中装入2(10.0g，0.072mol)、1(24.1g，0.145mol)、n-BuOH(100mL)和DIPEA(13.9g，0.108mol)，并在120℃下搅拌内含物2小时。冷却反应混合物，并通过经布氏漏斗过滤分离出沉淀的固体，用冷己烷洗涤，并干燥，得到黄色固体状的3(12.5g，64％)。化合物3不经进一步纯化即用于下一步骤中。
步骤2
向3(1.5g，5.58mmol)和4(1.48g，5.58mmol)于乙醇(30.0mL)中的溶液中添加冰乙酸(0.167g，2.79mmol)，并在压力管中，于90℃下搅拌反应混合物48小时。冷却反应混合物并在减压下浓缩；用10％碳酸氢钠溶液(20.0mL))淬灭残余物，并用乙酸乙酯萃取2次，每次50mL。用水(25mL)和盐水(25mL)洗涤合并的萃取物，用Na2SO4干燥并在减压下浓缩，得到粗品5。借助管柱色谱法(中性Al2O3，MeOH/氯仿：0.5/99.5)纯化粗残余物，得到褐色固体状的5(1.4g，50.3％)。
步骤3
向5(1.4g，2.8mmol)于乙醇(50mL)中的溶液中添加10％Pd/C(0.28g，以重量比计10％)，并在室温下，于氢气氛围(1.5Kg氢气压力)下搅拌反应混合物16小时。反应混合物经垫过滤，并在减压下浓缩，得到残余物。借助管柱色谱法(中性Al2O3，MeOH/氯仿：0.5/99.5)进一步纯化粗残余物，得到固体，用二氯甲烷/己烷混合物洗涤，得到淡褐色固体状的6(0.7g，53.4％)。
步骤4
3-(3-(4-(3-丙烯酰胺基苯基氨基)-5-氟嘧啶-2-基氨基)苯氧基)丙基氨基甲酸叔丁酯。在0℃下，向经搅拌的6(0.25g，0.533mmol)和碳酸钾(0.138g，1.02mmol)于NMP(2.5mL)中的溶液中添加丙烯酰氯(0.060g，0.665mmol)，并在0℃下搅拌反应混合物30分钟。将反应混合物逐滴添加到搅拌的冷10％NaHCO3溶液中，并在相同温度(0℃)下搅拌30分钟。沉淀析出白色固体，并通过经布氏漏斗过滤进行分离。用冷水和己烷洗涤固体，并将其溶解于甲醇/二氯甲烷混合物(50:50，10mL)中，且在减压下浓缩。将得到的残余物悬浮于冷水(25mL)中，添加Et3N，并用乙酸乙酯萃取2次，每次50mL。用水(50mL)、盐水(50mL)洗涤合并的萃取物，用Na2SO4干燥并在减压下浓缩，得到浅黄色固体状的I-183(0.255g，91.4％)。1H NMR(DMSO-d6)δppm:1.36(s,9H),1.78(五重峰,J＝6.4Hz,2H),3.01-3.06(m,2H),3.83(t,J＝6.12Hz,2H),5.74(dd,J＝1.4&10.04Hz,1H),6.24(d,J＝16.84Hz,1H),6.41-6.48(m,2H),6.88(s,1H),7.03(t,J＝8.24Hz,1H),7.23-7.31(m,3H),7.41(d,J＝8.28Hz,1H),7.56(d,J＝7.96Hz,1H),7.90(s,1H),8.11(d,J＝3.56Hz,1H),9.11(s,1H),9.43(s,1H),10.10(s,1H)；LCMS:m/e 523.1(M+1)。
实例64
制备3-(4-(4-(3-丙烯酰胺基苯基氨基)-5-氟嘧啶-2-基氨基)苯氧基)丙基氨基甲酸叔丁酯I-198
根据实例63中所述的方案、步骤和中间物，在步骤2中使用3-(4氨基苯氧基)丙基氨基甲酸叔丁酯代替4，来制备标题化合物。1H NMR(DMSO-d6)δppm:1.37(s,9H),1.78(五重峰,J＝6.36Hz,2H),3.05(q,J＝6.24Hz,2H),3.86(t,J＝6.2Hz,2H),5.75(dd,J＝1.92&10.04Hz,1H),6.24(dd,J＝1.92&16.92Hz,1H),6.45(dd,J＝10.08&16.92Hz,1H),6.72(d,J＝9Hz,2H),6.89(t,J＝5.4Hz,1H),7.26(t,J＝8.08Hz,1H),7.40(d,J＝8.12Hz,1H),7.48-7.52(m,3H),7.92(s,1H),8.05(d,J＝3.72Hz,1H),8.95(s,1H),9.36(s,1H),10.12(s,1H)；LCMS:m/e 523.2(M+1)。
根据下文所示的方案制备中间物3-(4氨基苯氧基)丙基氨基甲酸叔丁酯。
A)NaH，THF，室温，16小时；B)H2，Pd/C，EtOH，室温，16小时
步骤1
在0℃下，向经搅拌的1(1.7g，9.7mmol)于无水THF(40mL)中的溶液中添加NaH(0.72g，18.0mmol，60％于石蜡油中的分散液)，并在室温下，于氮气氛围下搅拌反应混合物15分钟。向其中添加2(2.0g，13.87mmol)，并在室温下搅拌反应混合物16小时。用冷水(20mL)对其进行淬灭，并用乙酸乙酯(25mL)萃取。用水(2次，每次10mL)、盐水(10mL)洗涤乙酸乙酯溶液，用Na2SO4干燥，并在减压下浓缩，得到油状液体，所述液体用己烷湿磨，得到黄色结晶固体状的3(2.0g，69.5％)。
步骤2
向3(2.0g，6.749mmol)于乙醇(30mL)中的溶液中添加10％Pd/C(0.4g，以重量比计20％)，并在室温下，于氢气氛围(1.5Kg氢气压力)下搅拌反应混合物16小时。反应混合物经垫过滤，并在减压下浓缩，得到带粉红色的粘稠油状的4(1.6g，89.3％)。其不经进一步纯化即用于下一步骤中。
实例65
制备4-(3丙烯酰胺基苯基氨基)-5-氟-2-(3,4-二甲氧基苯基氨基)-嘧啶I-134
根据实例20中所述的方案、步骤和中间物，在步骤2中使用3,4-二甲氧基苯胺代替4，来制备标题化合物。1H NMR(200MHz,CD3OD)δ8.50(s,1H),7.80(d,J＝6.5Hz,1H),7.70-7.66(m,2H),7.20(m,1H),7.0(m,2H),6.41(m,2H),5.92(dd,J＝8.0,2.0Hz,1H),3.89(s,6H)。
实例66
制备4-(3-丙烯酰胺基苯基氨基)-5-氟-2-(3,4,5-三甲氧基苯基氨基)-嘧啶I-133
根据实例20中所述的方案、步骤和中间物，在步骤2中使用3,4,5-三甲氧基苯胺代替4，来制备标题化合物。1H NMR(200MHz,CD3OD)δ8.10(s,1H),8.0(d,J＝6.0Hz,1H),7.50(m,2H),7.30(m,1H),7.0(m,2H),6.45(m,2H),5.90(dd,J＝8.0,2.0Hz,1H),3.90(s,3H),3.89(s,9H)。
实例67
制备4-(3-丙烯酰胺基苯基氨基)-5-氟-2-(3-(羟甲基)苯基氨基)-嘧啶I-145
根据实例20中所述的方案、步骤和中间物，在步骤2中使用3-羟甲基苯胺代替4，来制备标题化合物。1H NMR(DMSO-d6)δppm:4.38(d,J＝5.6Hz,2H),5.07(t,J＝5.68Hz,1H),5.75(d,J＝10.84Hz,1H),6.24(dd,J＝16.96Hz,1H),6.44(dt,J＝10.04&17.0Hz,1H),6.83(d,J＝7.4Hz,1H),7.10(t,J＝7.72Hz,1H),7.28(t,J＝8.16Hz,1H),7.40(d,J＝8.08Hz,1H),7.55-7.59(m,3H),7.92(s,1H),8.09(d,J＝3.6Hz,1H),9.11(s,1H),9.40(s,1H),10.1(s,1H)；LCMS:m/e 378.0(M+1)。
实例68
制备4-(3-丙烯酰胺基苯基氨基)-5-氟-2-(3-(3-(2-氧代吡咯烷-1-基)丙氧基)苯基氨基)-嘧啶I-144
根据实例20中所述的方案、步骤和中间物，在步骤2中使用3-(2-氧代吡咯烷-1-基)丙氧基苯胺代替4，来制备标题化合物。1H NMR(DMSO-d6)δppm:1.8-1.94(m,4H),2.18(q,J＝8.08Hz,2H),3.26-3.40(m,4H),3.80(t,J＝6Hz,2H),5.74(d,J＝10.72Hz,1H),6.24(d,J＝15.64Hz,1H),6.41-6.80(m,2H),7.04(t,J＝8.16Hz,1H),7.22-7.29(m,2H),7.33(s,1H),7.42(d,J＝8.08Hz,1H),7.55(d,J＝7.52Hz,1H),7.91(s,1H),8.11(d,J＝3.48Hz,1H),9.13(s,1H),9.43(s,1H),10.11(s,1H)；LCMS:m/e 491(M+1)。
实例69
制备4-(3-丙烯酰胺基苯基氨基)-5-氟-2-(3-(3-(甲磺酰基)丙氧基)苯基氨基)-嘧啶I-138
根据实例20中所述的方案、步骤和中间物，在步骤2中使用3-(3-(甲磺酰基)丙氧基苯胺代替4，来制备标题化合物。1H NMR(DMSO-d6)δppm:2.05-2.15(m,2H),3.0(s,3H),3.22(t,J＝7.76Hz,2H),3.93(t,J＝6.08Hz,2H),5.74(dd,J＝1.88&10Hz,1H),6.25(dd,J＝1.8&16.88Hz,1H),6.44(dd,J＝10.16&16.84Hz,2H),7.05(t,J＝8.16Hz,1H),7.24-7.30(m,2H),7.35(s,1H),7.42(d,J＝8.2Hz,1H),7.55(d,J＝8Hz,1H),7.90(s,1H),8.11(d,J＝3.6Hz,1H),9.14(s,1H),9.43(s,1H),10.10(s,1H)；LCMS:m/e 484(M+1)。
根据下文所示的方案制备中间物3-(3-(甲磺酰基)丙氧基苯胺。
A)DEAD，Ph3P，Et3N，THF，室温，1小时；B)MCPBA，CH2Cl2，室温，30分钟；C)TFA，CH2Cl2，室温，1小时
步骤1
在氮气氛围下，向经搅拌的2(1.1g，10.3mmol)于THF(20mL)中的溶液中添加1(2.18g，10.3mmol)、PPh3(2.98g，11.3mmol)和Et3N(1.68g，15mmol)。将反应混合物冷却到0℃，并向其中添加DEAD(1.98g，11.3mmol)。使反应混合物达到室温，并搅拌1小时。用水淬灭反应混合物，用乙酸乙酯萃取3次，每次25mL，并用水和盐水溶液(各5mL)洗涤合并的EtOAc萃取物。借助管柱色谱法(SiO2，60-120，石油醚/乙酸乙酯，8/2)纯化在减压下浓缩后得到的残余物，得到白色固体状的3(2g 60.6％)。
步骤2
在-10℃下，向经搅拌的3(2g，6.7mmol)于CH2Cl2(25mL)中的溶液中添加m-CPBA(4.13g，26.7mmol)。使反应混合物达到室温，并搅拌30分钟。用Na2CO3溶液(10mL)淬灭反应混合物，用CH2Cl2(10mL)萃取，用Na2SO4干燥，过滤并在减压下浓缩。借助管柱色谱法(SiO2，60-120，氯仿/甲醇9/1)进一步纯化残余物，得到黄色油状的4(1.05g，68.8％)。
步骤3
在0℃下，向经搅拌的4(0.75g，2.2mmol)于CH2Cl2(7.5mL)中的溶液中添加TFA(3体积)。使反应混合物达到室温，并在室温下再搅拌1小时。在减压下浓缩反应混合物，用NaHCO3溶液(5mL)碱化，并用CH2Cl2萃取3次，每次10mL。用水(2mL)和盐水溶液(2mL)洗涤合并的有机萃取物。用Na2SO4干燥，随后过滤并在减压下浓缩，得到褐色固体状的5(500mg，96％)。
实例70
制备N-(3-(5-氟-2-(3-(2-羟基乙氧基)苯基氨基)嘧啶-4-基氨基)苯基)丙烯酰胺I-105
根据实例20中所述的方案、步骤和中间物，在步骤2中使用3-(2-羟基)乙氧基苯胺代替4，来制备标题化合物。1H NMR(DMSO-d6)δppm:3.67(dd,J＝4.5&10Hz,2H),3.85-3.87(m,2H),4.83(t,J＝5.6Hz,1H),5.75(bd,J＝10Hz,1H),6.25(d,J＝15.6Hz,1H),6.42-6.46(m,2H),7.05(t,J＝8.4Hz,1H),7.26(d,J＝8Hz,1H),7.30(d,J＝8Hz,1H),7.33(s,1H),7.41(d,J＝8Hz,1H),7.57(d,J＝8Hz,1H),7.92(s,1H),8.11(d,J＝3.6Hz,1H),9.11(s,1H),9.42(s,1H),10.11(s,1H)；LCMS:m/e 409.9(M+1)。
根据下文所示的方案制备中间物3-(2-羟基)乙氧基苯胺。
A)K2CO3，DMF，70℃，12小时；B)Pd-C，H2，乙醇，室温，10小时；C)1M LAH溶液，THF，-15℃，45分钟。
步骤1
向经搅拌的1(2.0g，14.37mmol)和K2CO3(3.95g，28.6mmol)于无水DMF(15mL)中的溶液中添加2(2.88g，17.25mmol)，并在室温70℃下，于氮气氛围下搅拌反应物12小时。冷却反应混合物，在减压下浓缩并用乙酸乙酯(50mL)稀释残余物。用水(2次，每次10mL)、盐水(10mL)洗涤，用Na2SO4干燥，并在减压下浓缩，得到浅褐色液体状的3(2.5g，78％)。其不经进一步纯化即用于下一步骤中。
步骤2
向3(2.0g，8.88mmol)于乙醇(20mL)中的溶液中添加Pd/C(0.2g，以重量比计10％)，并在室温下，于氢气氛围(1.0Kg氢气压力)下搅拌反应混合物10小时。反应混合物经垫过滤，并在减压下浓缩，得到浅褐色液体状的4(1.6g，94％)。其不经进一步纯化即用于下一步骤中。
步骤3
在-15℃下，于氮气氛围下向搅拌的4(1.2g，6.14mmol)于无水THF(12mL))中的溶液中添加氢化锂铝(9.2mL，9.20mmol，1.0M的THF溶液)。使反应混合物达到室温，并在此温度下搅拌45分钟。用饱和氯化铵溶液淬灭反应混合物，并经垫过滤，且用EtOAc萃取2次，每次20mL。用盐水(10mL)洗涤合并的有机层，并在减压下浓缩，得到深褐色液体状的A(0.9g，95％)。其不经进一步纯化即用于下一步骤中。
实例71
制备N-(3-(5-氟-2-(3-(2-羟基-2-甲基丙氧基)苯基氨基)嘧啶-4-基氨基)苯基)丙烯酰胺I-118
根据下文所述的方案、步骤和中间物制备标题化合物。
A)DIPEA，n-BuOH，110℃，16小时；B)Pd(OAc)2，BINAP，Cs2CO3，甲苯，100℃，16小时；C)MeMgBr(3M的乙醚溶液)，THF，-78℃，3小时；D)TFA，CH2Cl2，室温，3小时。E)K2CO3，NMP，室温，45分钟。
步骤1
根据实例20中所述的方案、步骤和中间物制备化合物3。
步骤2
在100℃下，于氮气氛围下将4(0.7g，3.5mmol)、3(1.45g，4.3mmol)、Pd(OAc)2(0.03g，0.14mmol)、BINAP(0.13g，0..21mmol)和Cs2CO3(2.8g，8.7mmol)于经过脱气的甲苯(30mL)(用氮气净化甲苯30分钟)中的溶液加热16小时。冷却反应混合物，用EtOAc(15mL)稀释，并用水(10mL)、盐水(10mL)洗涤，并且用Na2SO4干燥。过滤，随后在减压下浓缩，得到残余物，借助管柱色谱法(SiO2，60-120，石油醚/乙酸乙酯，6/4)进一步纯化残余物，得到白色固体状的5(700mg，40％)。
步骤3
在-78℃下，向经搅拌的5(0.4g，0.8mmol)于THF(10mL))中的溶液中添加溴化甲基镁(3M的乙醚溶液，1.6mL，4.8mmol)。使反应混合物经3小时升温到-30℃，再冷却到-78℃，并用饱和氯化铵溶液(5mL)淬灭。混合物经过滤，并在减压下浓缩滤液，得到淡黄色固体状的6(300mg，78％)，其不经进一步纯化即用于下一步骤中。
步骤4
在0℃下，向经搅拌的6(0.2g，0.4mmol)于CH2Cl2(7.5mL)中的溶液中添加TFA(3体积)。使反应混合物达到室温，并在此温度下再搅拌3小时。在减压下浓缩反应混合物，用NaHCO3溶液(5mL)碱化，并用CH2Cl2萃取3次，每次10mL。用水(2mL)和盐水溶液(2mL)洗涤合并的有机萃取物。用Na2SO4干燥，随后过滤并在减压下浓缩，得到残余物，借助管柱色谱法(SiO2，60-120，石油醚/乙酸乙酯，6/4)进一步纯化残余物，得到白色固体状的7(130mg，86％)。
步骤5
在0℃下，向经搅拌的7(0.08g，0.2mmol)和碳酸钾(0.11g，0.8mmol)于NMP(1mL)中的溶液中添加8(0.023g，0.22mmol)，并在0℃下搅拌反应混合物45分钟。将反应混合物逐滴添加到搅拌的冷10％NaHCO3溶液中，并在相同温度(0℃)下搅拌30分钟。通过经布氏漏斗过滤来分离沉淀析出的固体。用冷水、己烷洗涤固体，并将其溶解于甲醇/二氯甲烷混合物(50:50，5mL)中，且在减压下浓缩。将得到的残余物悬浮于冷水(10mL)中，向其中添加Et3N，并用乙酸乙酯萃取2次，每次5mL。用水(2mL)、盐水(2mL)洗涤合并的乙酸乙酯萃取物，用Na2SO4干燥并在减压下浓缩。借助管柱色谱法(SiO2，60-120，石油醚/乙酸乙酯，5/5)纯化得到的残余物，得到白色固体状的I-118(35mg，38％)。1H NMR(CD3OD)δppm:1.27(s,6H),3.67(s,2H),5.76(dd,J＝2.4&9.6Hz,1H),6.34(dd,J＝2&16.8Hz,1H),6.42(dd,J＝9.6&16.8Hz,1H),6.54(td,J＝2&7.2Hz,1H),7.07-7.12(m,2H),7.27-7.31(m,2H),7.40(d,J＝8Hz,1H),7.45(d,J＝8Hz,1H),7.92(d,J＝4Hz,1H),8.07(d,J＝2Hz,1H)；LCMS:m/e 436.2(M-1)。
实例72
制备N-(3-(5-氟-2-(3-(2-(N-吗啉基)-2-氧代乙氧基)苯基氨基)嘧啶-4-基氨基)苯基)丙烯酰胺I-110
根据实例20中所述的方案、步骤和中间物，在步骤2中使用4-[(3-氨基苯氧基)乙酰基]-吗啉代替4，来制备标题化合物。1H NMR(DMSO-d6)δppm:3.4-3.5(bm,4H),3.5-3.6(bm,4H),4.69(s,2H),5.75(dd,J＝2&10Hz,1H),6.25(dd,J＝2&17.2Hz,1H),6.42-6.49(m,2H),7.05(t,J＝8Hz,1H),7.29(t,J＝8Hz,3H),7.41(d,J＝8Hz,1H),7.57(d,J＝8.8Hz,1H),7.91(s,1H),8.12(d,J＝3.6Hz,1H),9.15(s,1H),9.45(s,1H),10.12(s,1H)；LCMS:m/e491.0(M-2)。
根据下文所示的方案制备中间物4-[(3-氨基苯氧基)乙酰基]-吗啉。
A)LiOH，THF，MeOH，H2O，室温，4小时；B)SOCl2，85℃，吗啉，0℃，30分钟；C)Pd-C，H2，乙酸乙酯，室温，2小时。
步骤1
向经搅拌的1(1.0g，4.44mmol)于甲醇/THF/水：5mL/5mL/5mL中的溶液中添加单水合氢氧化锂(0.75g，17.76mmol)，并在室温下搅拌反应混合物4小时。在减压下浓缩反应混合物，用水(10mL)稀释残余物，用1.0N HCl(PH值约为5-6)酸化，并用乙醚萃取2次，每次20mL。用水(20mL)、盐水(20mL)洗涤合并的乙醚萃取物，用Na2SO4干燥并在减压下浓缩，得到灰白色固体状的2(0.8g，91.43％)。
步骤2
在氮气氛围下，将亚硫酰氯(2.0ml，27.56mmol)添加到2(0.2g，1.014mmo)中。将1滴N,N二甲基甲酰胺添加到混合物中，并在85℃下搅拌内含物2小时。冷却到室温后，通过在减压下浓缩去除亚硫酰氯。将残余物冷却到0℃，并分数小份向其中添加吗啉(0.5g，5.74mmol)，在0℃下搅拌反应混合物30分钟。使反应混合物达到室温，并在此温度下搅拌30分钟，冷却并用水(10mL)淬灭反应。用乙醚萃取内含物2次，每次10mL，并用水(5mL)、盐水(5mL)洗涤合并的乙醚萃取物，用Na2SO4干燥，并在减压下浓缩，得到黄色固体状的3(0.180g，66.67％)。
步骤3
向3(0.180g，0.676mmol)于乙酸乙酯(10mL)中的溶液中添加Pd/C(0.036g，以重量比计20％)，并在室温下，于氢气氛围(1.0Kg氢气压力)下搅拌反应混合物2小时。反应混合物经垫过滤，并在减压下浓缩，得到灰白色固体状的A(0.14g，87.67％)。其不经进一步纯化即用于下一步骤中。
实例73
制备N-(3-(5-氟-2-(3-(1-羟基-2-甲基丙-2-基氧基)苯基氨基)嘧啶-4-基氨基)苯基)丙烯酰胺I-91
根据实例20中所述的方案、步骤和中间物，在步骤2中使用3-(1-羟基-2-甲基丙-2-基氧基)苯胺代替4，来制备标题化合物。1H NMR(DMSO-d6)δppm:1.16(s,6H),3.32-3.35(m,2H),4.81(t,J＝5.74Hz,1H),5.74(dd,J＝1.84&10.04Hz,1H),6.24(dd,J＝1.88&16.96Hz,1H),6.44(dd,J＝10.12&16.96Hz,1H),6.50(dd,J＝2.12&7.96Hz,1H),7.02(t,J＝8.12Hz,1H),7.26-7.30(m,2H),7.41(d,J＝8.16Hz,1H),7.48(d,J＝8.24Hz,1H),7.57(d,J＝8.12Hz,1H),7.92(s,1H),8.09(d,J＝3.6Hz,1H),9.07(s,1H),9.41(s,1H),10.09(s,1H)；LCMS:m/e 438.0(M+1)。
根据下文所示的方案制备中间物3-(1-羟基-2-甲基丙-2-基氧基)苯胺。
A)K2CO3，DMF，16小时，室温；B)Pd/C，乙醇，5小时，室温；C)LAH(1M的THF溶液)，0℃到室温，2小时。
步骤1
向1(0.5g 3.59mmol)和2(0.84g 4.316mmol)的DMF溶液中添加K2CO3(0.99g，7.194mmol)。在室温下搅拌16小时后，在减压下浓缩反应混合物。用乙酸乙酯(10mL)稀释残余物，并用10％NaOH溶液(5mL)、水(5mL)和盐水溶液(5mL)洗涤。用Na2SO4干燥，随后在减压下浓缩，得到红褐色液体状的3(0.5g，52％)。
步骤2
向经搅拌的3(0.45g，1.77mmol)于乙醇(5mL)中的溶液中添加Pd/C(45mg)，并将反应混合物氢化(气囊压力为约1.5Kg)5小时。反应混合物经垫过滤，并在真空下浓缩，得到无色液体状的4(0.35g，88％)。
步骤3
在0℃下，于氮气下向经搅拌的4(0.25g，1.15mmol)于THF(5mL)中的溶液中添加LAH(3.45mL，3.35mmol，1M的THF溶液，)。使反应混合物达到室温，并在此温度下搅拌2小时。用饱和Na2SO4溶液(2mL)小心地淬灭反应，过滤并浓缩。借助管柱色谱法(SiO2，60-120，石油醚/乙酸乙酯，6/4)进一步纯化残余物，得到浅褐色液体状的5(0.15g，71％)。
实例74
制备N-(3-(5-氟-2-(3-(2-(2-氧代吡咯烷-1-基)乙氧基)苯基氨基)嘧啶-4-基氨基)苯基)丙烯酰胺I-164
根据实例20中所述的方案、步骤和中间物，在步骤2中使用3-(2-(2-氧代吡咯烷-1-基)乙氧基)苯胺代替4，来制备标题化合物。1H NMR(DMSO-d6)δppm:1.89(五重峰,J＝7.6Hz,2H),2.21(t,J＝8Hz,2H),3.40(t,J＝6.8Hz,2H),3.50(t,J＝5.6Hz,2H),3.93(t,J＝5.2Hz,2H),5.75(dd,J＝2&10Hz,1H),6.25(dd,J＝2&16.84Hz,1H),6.42-6.49(m,2H),7.05(t,J＝8.4Hz,1H),7.28(t,J＝8Hz,2H),7.33(s,1H),7.43(d,J＝8Hz,1H),7.57(d,J＝8Hz,1H),7.92(s,1H),8.12(d,J＝3.6Hz,1H),9.15(s,1H),9.45(s,1H),10.13(s,1H)；LCMS:m/e 475(M-2)。
实例75
制备N-(3-(5-氟-2-(6-(3-(甲磺酰基)丙氧基)吡啶-3-基氨基)嘧啶-4-基氨基)苯基)丙烯酰胺I-80
根据实例20中所述的方案、步骤和中间物，在步骤2中使用3-氨基-6-(3-(甲磺酰基)丙氧基)吡啶代替4，来制备标题化合物。1H NMR(DMSO-d6)δppm:2.05-2.20(m,2H),3.00(s,3H),3.24(t,J＝7.46Hz,2H),4.27(t,J＝6.32Hz,2H),5.75(dd,J＝1.76&10Hz,1H),6.25(dd,J＝1.8&16.96Hz,1H),6.45(dd,J＝10.04&16.92Hz,1H),6.65(d,J＝8.88Hz,1H),7.27(t,J＝8.08Hz,1H),7.39(d,J＝8.08Hz,1H),7.49(d,J＝8Hz,1H),7.92(s,1H),7.99(dd,J＝2.6&8.76Hz,1H),8.07(d,J＝3.64Hz,1H),8.31(d,J＝2.28Hz,1H),9.10(s,1H),10.11(s,1H)；LCMS:m/e 486.9(M+1)。
实例76
制备N-(3-(2-(6-环丁氧基吡啶-3-基氨基)-5-氟嘧啶-4-基氨基)苯基)丙烯酰胺I-79
根据实例20中所述的方案、步骤和中间物，在步骤2中使用3-氨基-6-环丁氧基吡啶代替4，来制备标题化合物。1H NMR(DMSO-d6)δppm:1.57-1.66(m,1H),1.71-1.78(m,1H),1.94-2.04(m,2H),2.32-2.38(m,2H),4.95-5.05(m,1H),5.73-5.76(m,1H),6.25(dd,J＝1.92&16.92Hz,1H),6.45(dd,J＝10.08&16.92Hz,1H),6.58(d,J＝8.84Hz,1H),7.25(t,J＝8.04Hz,1H),7.39(d,J＝7.84Hz,1H),7.45-7.55(m,1H),7.90(s,1H),7.94(dd,J＝2.72&8.88Hz,1H),8.06(d,J＝3.68Hz,1H),8.27(d,J＝2.6Hz,1H),9.04(s,1H),9.41(s,1H),10.1(s,1H)；LCMS:m/e 421.2(M+1)。
实例77
制备N-(3-(5-氟-2-(6-((1-甲基哌啶-4-基)甲氧基)吡啶-3-基氨基)嘧啶-4-基氨基)苯基)丙烯酰胺I-78
根据实例20中所述的方案、步骤和中间物，在步骤2中使用3-氨基-6-(1-甲基哌啶-4-基)甲氧基吡啶代替4，来制备标题化合物。1H NMR(DMSO-d6)δppm:1.23-1.27(m,3H),1.65-1.69(m,2H),1.83(t,J＝11.72Hz,2H),2.14(s,3H),2.75(d,J＝11.24Hz,2H),4.0(d,J＝6.2Hz,2H),5.74(dd,J＝2&10.04Hz,1H),6.24(dd,J＝1.96&16.92Hz,1H),6.45(dd,J＝10.08&16.92Hz,1H),6.62(d,J＝8.88Hz,1H),7.27(t,J＝8.08Hz,1H),7.40(d,J＝8.88Hz,1H),7.47(d,J＝7.6Hz,1H),7.92(s,1H),7.97(dd,J＝2.76&8.92Hz,1H),8.07(d,J＝3.72Hz,1H),8.28(d,J＝2.64Hz,1H),9.07(s,1H),9.41(s,1H),10.11(s,1H)；LCMS:m/e478.0(M+1)。
实例77
制备N-(3-(5-氟-2-(4-氯-3-甲氧基苯基氨基)嘧啶-4-基氨基)苯基)丙烯酰胺I-74
根据实例20中所述的方案、步骤和中间物，在步骤2中使用4-氯-3-甲氧基苯胺代替4，来制备标题化合物。1H NMR(DMSO-d6)δppm:3.64(s,3H),5.74(dd,J＝2.12&9.96Hz,1H),6.24(dd,J＝1.84&17Hz,1H),6.44(dd,J＝10&16.84Hz,1H),7.13(s,1H),7.28(t,J＝8.08Hz,1H),7.36(dd,J＝2.12&8.68Hz,1H),7.40(d,J＝7.64Hz,1H),7.45(d,J＝2.04Hz,1H),7.50(d,J＝8.12Hz,1H),7.91(s,1H),8.13(d,J＝3.52Hz,1H),9.28(s,1H),9.48(s,1H),10.12(s,1H)；LCMS:m/e 414.0(M+1)。
实例78
制备N-(3-(5-氟-2-(4-(2-羟基-2-甲基丙氧基)苯基氨基)嘧啶-4-基氨基)苯基)丙烯酰胺I-73
根据实例20中所述的方案、步骤和中间物，在步骤2中使用4-(2-羟基-2-甲基丙氧基)苯胺代替4，来制备标题化合物。1H NMR(MeOD)δppm:1.33(s,6H),3.75(s,2H),5.80(dd,J＝3.28&10.64Hz,1H),6.39(dd,J＝2.24&16.96Hz,1H),6.47(dd,J＝9.6&16.96Hz,1H),6.84(td,J＝3.48&9.0Hz,2H),7.30(t,J＝7.72Hz,1H),7.41-7.50(m,4H),7.89(d,J＝3.88Hz,1H),8.09(s,1H)；LCMS:m/e 438(M+1)。
实例79
制备N-(3-(5-氟-2-(6-(1,1-二氧离子基硫吗啉-4-基)吡啶-3-基氨基)嘧啶-4-基氨基)苯基)丙烯酰胺I-72
根据实例20中所述的方案、步骤和中间物，在步骤2中使用3-氨基-6-(1,1-二氧离子基硫吗啉-4-基)吡啶代替4，来制备标题化合物。1H NMR(DMSO-d6)δppm:3.00-3.15(bm,4H),3.90-4.10(bm,4H),5.76(dd,J＝1.64&10.04Hz,1H),6.26(dd,J＝1.72&16.92Hz,1H),6.46(dd,J＝10.04&16.88Hz,1H),6.87(d,J＝9.04Hz,1H),7.20(t,J＝8.04Hz,1H),7.39(d,J＝8.24Hz,1H),7.50(d,J＝7.68Hz,1H),7.90-7.93(m,2H),8.06(d,J＝3.6Hz,1H),8.35(d,J＝2.4Hz,1H),9.0(s,1H),9.40(s,1H),10.12(s,1H)；LCMS:m/e 484(M+1)。
实例80
制备N-(3-(5-氟-2-(6-(2-(2-氧代吡咯烷-1-基)乙氧基)吡啶-3-基氨基)嘧啶-4-基氨基)苯基)丙烯酰胺I-70
根据实例20中所述的方案、步骤和中间物，在步骤2中使用3-氨基-6-(2-(2-氧代吡咯烷-1-基)乙氧基)吡啶代替4，来制备标题化合物。1H NMR(DMSO-d6)δppm:1.90(五重峰,J＝7.6Hz,2H),2.19(t,J＝8.04Hz,2H),3.41(t,J＝6.88Hz,2H),3.50(t,J＝5.36Hz,2H),4.27(t,J＝5.48Hz,2H),5.75(d,J＝10.92Hz,1H),6.25(d,J＝17.04Hz,1H),6.45(dd,J＝10.12&16.84Hz,1H),6.63(d,J＝8.96Hz,1H),7.27(t,J＝8.04Hz,1H),7.39(d,J＝7.56Hz,1H),7.47(d,J＝7.32Hz,1H),7.92(s,1H),7.98(dd,J＝2.36&8.84Hz,1H),8.08(d,J＝3.3Hz,1H),8.31(d,J＝2.24Hz,1H),9.10(s,1H),9.44(s,1H),10.11(s,1H)；LCMS:m/e478.0(M+1)。
实例81
制备(R)-N-(3-(5-氟-2-(6-(四氢呋喃-3-基氧基)吡啶-3-基氨基)嘧啶-4-基氨基)苯基)丙烯酰胺I-69
根据实例20中所述的方案、步骤和中间物，在步骤2中使用(R)-3-氨基-6-(四氢呋喃-3-基氧基)吡啶代替4，来制备标题化合物。1H NMR(DMSO-d6)δppm:1.91-1.99(m,1H),2.14-2.23(m,1H),3.70-3.77(m,2H),3.81(dd,J＝7.90&15.48Hz,1H),3.88(dd,J＝4.76&10.16Hz,1H),5.38(t,J＝4.68Hz,1H),5.75(dd,J＝1.72&10.08Hz,1H),6.24(d,J＝16.92Hz,1H),6.45(dd,J＝10.16&16.88Hz,1H),6.63(d,J＝8.84Hz,1H),7.26(d,J＝7.64Hz,1H),7.39(d,J-＝7.92Hz,1H),7.46(d,J＝7.64Hz,1H),7.92(s,1H),7.97(dd,J＝2.6&8.83Hz,1H),8.07(d,J＝3.6Hz,1H),8.32(d,J＝2.48Hz,1H),9.08(s,1H),9.42(s,1H),10.10(s,1H)；LCMS:m/e 437.2(M+1)。
实例82
制备N-(3-(2-(4-氯-3-(3-(甲磺酰基)丙氧基)苯基氨基)-5-氟嘧啶-4-基氨基)苯基)丙烯酰胺I-55
根据实例20中所述的方案、步骤和中间物，在步骤2中使用4-氯-3-(3-(甲磺酰基)丙氧基)苯胺代替4，来制备标题化合物。1H NMR(DMSO-d6)δppm:2.07-2.14(m,2H),3.0(s,3H),3.22(t,J＝7.72Hz,2H),3.90(t,J＝6.08Hz,2H),5.75(dd,J＝1.88&10.08Hz,1H),6.24(dd,J＝1.84&16.92Hz,1H),6.44(dd,J＝10.12&16.96Hz,1H),7.15(d,J＝8.72Hz,1H),7.30(t,J＝8.08Hz,1H),7.35(dd,J＝2.2&8.8Hz,1H),7.43(d,J＝8Hz,1H),7.45-7.55(m,2H),7.91(s,1H),8.14(d,J＝3.56Hz,1H),9.31(s,1H),9.49(s,1H),10.14(s,1H)；LCMS:m/e 520.0(M+1)。
实例83
制备N-(3-(2-(3-氟-4-(2-甲氧基乙氧基)苯基氨基)-5-氟嘧啶-4-基氨基)苯基)丙烯酰胺I-96
根据实例20中所述的方案、步骤和中间物，在步骤2中使用3-氟-4-(2-甲氧基乙氧基)苯胺代替4，来制备标题化合物。1H NMR(DMSO,400MHz)δ10.13(s,1H),9.43(s,1H),9.18(s,1H),8.09(d,1H,J＝3.68Hz),7.92(s,1H),7.65(dd,1H,J＝2.3,14.2Hz),7.47(d,1H,J＝8.24Hz),7.41(d,1H,J＝8.28Hz),7.27(t,2H,J＝8.0Hz),6.94(t,1H,J＝9.4Hz),6.44(dd,1H,J＝16.96,10.1Hz),6.23(dd,1H,J＝1.84,16.96Hz),5.73(dd,1H,J＝1.4,10.1Hz),4.04(m,2H),3.61(m,2H),3.29(s,3H)。MS m/z:442.0(M+H+)。
实例84
制备N-(3-(2-(4-叔丁氧羰基-2,3-二氢苯并[1,4]噁嗪-6-基)氨基-5-氟嘧啶-4-基氨基)苯基)丙烯酰胺I-175
根据实例20中所述的方案、步骤和中间物，在步骤2中使用6-氨基-4-叔丁氧羰基-2,3-二氢苯并[1,4]噁嗪代替4，来制备标题化合物。MS m/z:507.1(M+H+)。
实例85
制备N-(3-(2-(4-叔丁氧羰基-2,3-二氢苯并[1,4]噁嗪-6-基)氨基-5-氟嘧啶-4-基氨基)苯基)丙烯酰胺I-174
通过在室温下，用4N HCl的二噁烷溶液处理实例84的产物1小时，随后在真空中去除溶剂，来制备标题化合物。MS m/z:407.1(M+H+)。
实例86
制备N-(3-(2-(4-三氟乙酰基-2,3-二氢苯并[1,4]噁嗪-6-基)氨基-5-氟嘧啶-4-基氨基)苯基)丙烯酰胺I-143
通过在室温下，用三氟乙酸酐处理实例85的产物1小时，随后在真空中去除溶剂，来制备标题化合物。MS m/z:503.1(M+H+)。
实例87
制备N-(3-(2-(4-甲磺酰基-2,3-二氢苯并[1,4]噁嗪-6-基)氨基-5-氟嘧啶-4-基氨基)苯基)丙烯酰胺I-140
通过在0℃下，用甲磺酰氯Et3N的CH2Cl2溶液处理实例85的产物30分钟，随后用NaHCO3水溶液洗涤，用Na2SO4干燥，并在真空中去除溶剂，来制备标题化合物。MS m/z:485.1(M+H+)。
实例88
制备N-(3-(2-(4-甲基-2,3-二氢苯并[1,4]噁嗪-6-基)氨基-5-氟嘧啶-4-基氨基)苯基)丙烯酰胺I-126
根据实例20中所述的方案、步骤和中间物，在步骤2中使用6-氨基-4-甲基-2,3-二氢苯并[1,4]噁嗪代替4，来制备标题化合物。MS m/z:421.1(M+H+)。
实例89
制备N-(3-(2-(4-乙酰基-2,3-二氢苯并[1,4]噁嗪-6-基)氨基-5-氟嘧啶-4-基氨基)苯基)丙烯酰胺I-112
通过在室温下，用乙酸酐和吡啶的CH2Cl2溶液处理实例85的产物1小时，随后用1NHCl洗涤，随后用NaHCO3水溶液洗涤，用Na2SO4干燥，并在真空中去除溶剂，来制备标题化合物。MS m/z:449.1(M+H+)。
实例90
制备N-(3-(2-(1-叔丁氧羰基-1H-吲唑-5-基)氨基)-5-氟嘧啶-4-基氨基)苯基)丙烯酰胺I-151
根据实例20中所述的方案、步骤和中间物，在步骤2中使用5-氨基-N-(叔丁氧羰基)-1H-吲唑代替4，来制备标题化合物。MS m/z:490.2(M+H+)。
实例91
制备N-(3-(2-(1H-吲唑-5-基)氨基)-5-氟嘧啶-4-基氨基)苯基)丙烯酰胺I-156
通过在室温下，用4N HCl的二噁烷溶液处理实例90的产物1小时，随后在真空中去除溶剂，来制备标题化合物。MS m/z:390.1(M+H+)。
实例92
制备N-(3-(2-(1-甲基-1H-吲唑-5-基)氨基)-5-氟嘧啶-4-基氨基)苯基)丙烯酰胺I-155
根据实例20中所述的方案、步骤和中间物，在步骤2中使用5-氨基-1-甲基-1H-吲唑代替4，来制备标题化合物。MS m/z:404.2(M+H+)。
实例93
制备N-(3-(5-氟-2-(3-氨磺酰基苯基氨基)嘧啶-4-基氨基)苯基)丙烯酰胺I-160
根据下文所述的方案、步骤和中间物制备标题化合物。
A)DIPEA，正丁醇，120℃，2小时，压力管；B)AcOH，乙醇，90℃，16小时；C)Pd-C，H2，乙醇，室温，3小时；D)丙烯酰氯，K2CO3，NMP，0℃，60分钟。
步骤1
向压力管中装入2(10.0g，0.072mol)、1(24.1g，0.145mol)、n-BuOH(100mL)和DIPEA(13.9g，0.108mol)，并在120℃下搅拌内含物2小时。冷却反应混合物，通过经布氏漏斗过滤分离出沉淀的固体，用冷己烷洗涤，并干燥，得到黄色固体状的3(12.5g，64％)。其不经进一步纯化即用于下一步骤中。
步骤2
向3(0.25g，0.93mmol)和4(0.16g，0.93mmol)于乙醇(2.5mL)中的溶液中添加冰乙酸(0.083g，1.39mmol)，并在压力管中，于90℃下搅拌反应混合物16小时。冷却反应混合物，通过经布氏漏斗过滤分离出沉淀的固体，用冷乙醚洗涤，并干燥，得到褐色固体状的5(0.245g，65％)。其不经进一步纯化即用于下一步骤中。
步骤3
向5(0.1g，0.24mmol于甲醇(4mL)中)的溶液中添加10％Pd/C(0.2g，以重量比计20％)，并在室温下，于氢气氛围(1.5Kg氢气压力)下搅拌反应混合物3小时。反应混合物经垫过滤，并在减压下浓缩，得到褐色固体状的6(0.076g，82％)。其不经进一步纯化即用于下一步骤中。
步骤4
在0℃下，向经搅拌的6(0.07g，0.18mmol)和碳酸钾(0.051g，0.37mmol)于NMP(0.7mL)中的溶液中添加丙烯酰氯(0.021g，0.23mmol)，并在0℃下搅拌反应混合物60分钟。将反应混合物逐滴添加到搅拌的冷10％NaHCO3溶液中，并在相同温度(0℃)下保持30分钟。通过经布氏漏斗过滤来分离沉淀析出的固体。用冷水和己烷洗涤固体，并将其溶解于甲醇/二氯甲烷混合物(50:50，5mL)中，且在减压下浓缩。将得到的残余物悬浮于冷水(10mL)中，向其中添加Et3N，并用乙酸乙酯萃取2次，每次10mL。用水(5mL)、盐水(5mL)洗涤合并的乙酸乙酯萃取物，用Na2SO4干燥并在减压下浓缩，得到残余物。借助管柱色谱法(中性Al2O3，MeOH/氯仿：3/97)进一步纯化粗残余物，得到浅褐色固体状的I-160(0.028g，35％)。1H NMR(DMSO-d6)δppm:5.75(dd,J＝1.68&10.24Hz,1H),6.25(dd,J＝1.8&17Hz,1H),6.43(dd,J＝10&16.92Hz,1H),7.27-7.35(m,5H),7.40(d,J＝8Hz,1H),7.60(d,J＝8.16Hz,1H),7.92(s,1H),7.95-8.05(m,1H),8.07(s,1H),8.14(d,J＝3.52Hz,1H),9.50(s,2H),10.12(s,1H)；LCMS:m/e 428.9(M+1)。
实例94
制备N-(3-(5-氰基-2-(4-(2-甲氧基乙氧基)苯基氨基)嘧啶-4-基氨基)苯基)丙烯酰胺I-109
根据下述步骤和中间物制备标题化合物。
A)DMA，K2CO3，室温，10小时，压力管；B)PTSA，二噁烷，100℃，2小时；C)Zn(CN)2，Ph3P，DMF，120℃，12小时；D)4N HCl，二噁烷，室温，1小时；随后丙烯酰氯，Et3N，DCM，-10℃，10分钟。
步骤1
向5-溴-2,4-二氯嘧啶(0.45g，2.0mmol)和3-氨基苯基氨基甲酸叔丁酯(0.44g，2.1mmol)于DMA(3mL)中的溶液中添加K2CO3(0.55g，4.0mmol)。搅拌悬浮液10小时。添加水(10mL)并借助过滤来收集沉淀物。用乙醚洗涤固体，并干燥，得到0.8g化合物3。MS:m/e＝399.1,401.2(M+1)。
步骤2
向化合物3(400mg，1.0mmol)和4-(2-甲氧基乙氧基)苯胺(0.2g，1.2mmol)于8ml二噁烷中的溶液中添加单水合4-甲基苯磺酸(0.15g，0.8mmol)。在100℃下搅拌混合物2小时。蒸发溶剂。将残余物溶解于30ml乙酸乙酯中，并用NaHCO3水溶液、水和盐水洗涤。分离有机层，并用Na2SO4干燥。去除溶剂后，用硅胶对粗产物进行色谱分离(己烷:EtOAc＝1:1)。得到0.40g标题化合物5。MS m/z:530.1,532.1(M+H+)。
步骤3
向Zn(CN)2(0.24g，2.0mmol)、Pd(PPh3)4(60mg，0.05mmol)于3ml DMF中的悬浮液中添加5(0.25g，0.5mmol)。使混合物脱气，并在氩气下密封，且在120℃下加热12小时。添加水(10ml)并借助过滤来收集沉淀物。用乙醚洗涤固体，并干燥，得到0.2g化合物6。MS:m/e＝477.1(M+1)。
步骤4
将化合物6(0.10g，0.21mmol)溶解于4N HCl(2mL)的二噁烷溶液中。在室温下搅拌混合物1小时。去除溶剂后，倒入一份5mL DCM，随后蒸发至干燥。将所述添加DCM随后蒸发的过程重复3次，得到残余固体，其直接用于下一步骤中。MS m/z:377.0(M+H+)。
在-10℃下，向上文得到的中间物、三乙胺(0.1ml，0.8mmol)于2ml二氯甲烷中的溶液中添加丙烯酰氯(19mg，0.21mmol)。在-10℃下搅拌反应物10分钟，并用NaHCO3水溶液淬灭反应。添加乙酸乙酯(10mL)，并用NaHCO3水溶液、水和盐水洗涤。分离有机层，并用Na2SO4干燥。去除溶剂后，用硅胶对粗产物进行色谱分离(己烷:EtOAc＝1:2)，得到30mg标题化合物。MS m/z:431.1(M+H+)。
实例95
制备N-(3-(5-氰基-2-(6-甲氧基吡啶-3-基氨基)嘧啶-4-基氨基)苯基)丙烯酰胺I-173
根据实例94中所述的方案、步骤和中间物，在步骤2中使用3-氨基-6-甲氧基吡啶代替4，来制备标题化合物。MS m/z:388.2(M+H+)。
实例96
制备N-(3-(5-环丙基-2-(4-(2-甲氧基乙氧基)苯基氨基)嘧啶-4-基氨基)苯基)丙烯酰胺I-139
根据下述步骤和中间物制备标题化合物。
A)环丙基三氟硼酸钾，Pd(OAc)2，Xanphos，Cs2(CO3)，甲苯，100℃，12小时；B)PTSA，二噁烷，100℃，2小时；C)Zn(CN)2，Ph3P，DMF，120℃，12小时；D)4N HCl，二噁烷，室温，1小时；随后丙烯酰氯，Et3N，DCM，-10℃，10分钟。
步骤1
将环丙基三氟硼酸钾(0.4g，3.0mmol)、化合物1(1.0g，2.5mmol)、乙酸钯(34mg，0.15mmol)、Xanphos(0.17g，0.3mmol)和Cs2CO3(2.4g，7.5mmol)悬浮于25ml甲苯和5ml水中。使混合物脱气，在氩气下密封，并在100℃下加热12小时。添加50ml乙酸乙酯，并用NaHCO3水溶液、水和盐水洗涤。分离有机层，并用Na2SO4干燥。去除溶剂后，用硅胶对粗产物进行色谱分离(己烷:EtOAc＝3:2)。得到0.54g标题化合物2。MS m/z:361.2(M+H+)。
步骤2
根据实例94步骤2中所述的程序，由化合物2和3制备化合物4。MS m/z:492.2(M+H+)。
步骤3
根据实例94步骤4中所述的程序，由化合物4制备标题化合物I-139。MS m/z:446.1(M+H+)。
实例97
制备N-(3-(5-环丙基-2-(6-甲氧基吡啶-3-基氨基)嘧啶-4-基氨基)苯基)丙烯酰胺I-167
根据实例96中所述的方案、步骤和中间物，在步骤2中使用3-氨基-6-甲氧基吡啶代替3，来制备标题化合物。MS m/z:403.2(M+H+)。
实例98
制备N-(3-(5-氟-2-(3-(3-(2-氧代吡咯烷-1-基)丙氧基)苯基氨基)嘧啶-4-基氧基)苯基)丙烯酰胺I-162
根据下文所述的方案、步骤和中间物制备标题化合物。
A)DIPEA，n-BuOH，110℃，16小时；B)Pd(OAc)2，BINAP，Cs2CO3，甲苯，100℃，16小时；C)TFA，CH2Cl2，室温，2小时；D)K2CO3，NMP，室温，45分钟。
步骤1
向压力管中装入2(2.0g，9.61mmol)、1(3.21g，19.23mmol)、n-BuOH(30mL)和DIPEA(1.86g，14.42mmol)，并在110℃下搅拌内含物16小时。冷却反应混合物，在减压下浓缩，用水(30mL)淬灭，并用乙酸乙酯萃取2次，每次30mL。用水(20mL)、盐水(20mL)洗涤合并的乙酸乙酯萃取物，用Na2SO4干燥并在减压下浓缩，得到残余物。残余物用己烷湿磨，得到黄色固体状的3(2.5g，96％)。
步骤2
向3(0.36g，1.1mmol)于甲苯(15mL)中的溶液中添加3-(3-(2-氧代吡咯烷-1-基)丙氧基苯胺4(0.25g，1.1mmol)，随后添加BINAP(0.031g，0.05mmol)、乙酸钯(0.0022g，0.01mmol)和Cs2CO3(0.82g，2.5mmol)。搅拌反应混合物，并向其中鼓入氮气，持续15分钟。在100℃下，于氮气氛围下将其加热8小时。将反应混合物冷却到室温，用乙酸乙酯(30mL)稀释，用水(15mL)、盐水(15mL)洗涤，并用Na2SO4干燥。在减压下浓缩，得到残余物，借助管柱色谱法(SiO2，60-120，以3％甲醇/氯仿：3/97洗脱产物)纯化残余物，得到黄色固体状的5(0.3g，60％)。
步骤3
在0℃下，向经搅拌的5(0.25g，0.46mmol)于CH2Cl2(10mL)中的溶液中添加TFA(1.0mL)。使反应混合物达到室温，并在此温度下搅拌2小时。将粗反应混合物倒入冰冷的水(10mL)中，用碳酸氢钠溶液碱化，并用乙酸乙酯萃取3次，每次15mL。用水(15mL)、盐水(10mL)洗涤合并的乙酸乙酯萃取物，用Na2SO4干燥并在减压下浓缩，得到黄色固体状的6(0.130g，65％)。其不经进一步纯化即用于下一步骤中。
步骤4
在0℃下，向经搅拌的6(0.08g，0.18mmol)和碳酸钾(0.124g，0.9mmol)于NMP(1.2mL)中的溶液中添加丙烯酰氯(0.020g，0.22mmol)，并在0℃下搅拌反应混合物45分钟。将反应混合物逐滴添加到搅拌的冷10％NaHCO3溶液中，并在相同温度(0℃)下搅拌30分钟。通过经布氏漏斗过滤来分离沉淀析出的固体。用冷水、己烷洗涤固体，并将其溶解于甲醇/二氯甲烷混合物(50:50，5mL)中，且在减压下浓缩。将得到的残余物悬浮于冷水(10mL)中，向其中添加Et3N，并用乙酸乙酯萃取2次，每次10mL。用水(5mL)、盐水(5mL)洗涤合并的乙酸乙酯萃取物，用Na2SO4干燥并在减压下浓缩，得到I-162(0.050mg，56％)。1H NMR(DMSO-d6)δppm:1.81-1.91(m,4H),2.19(t,J＝7.84Hz,2H),3.26-3.35(m,4H),3.73(t,J＝6.04Hz,2H),5.76(dd,J＝1.92&10.04Hz,1H),6.25(dd,J＝1.88&16.9Hz,1H),6.38-6.45(m,2H),6.93(t,J＝8.12Hz,1H),7.02-7.04(m,2H),7.11(s,1H),7.43(t,J＝8.16Hz,1H),7.55(d,J＝8.24Hz,1H),7.68(d,J＝1.8Hz,1H),8.56(d,J＝2.88Hz,1H),9.56(s,1H),10.34(s,1H)；LCMS:m/e 490.0(M-2)。
根据下文所示的方案制备中间物3-(3-(2-氧代吡咯烷-1-基)丙氧基苯胺4。
A)NaH，DMF，室温，16小时；B)SnCl2，浓HCl，50℃，2小时。
步骤1
在0℃下，向经搅拌的NaH(1.0g，20.94mmol)于DMF(10mL)中的溶液中添加1(2.0g，13.96mmol)。使反应混合物达到室温，并在此温度下搅拌30分钟。向反应混合物中缓慢添加2(1.96g，13.96mmol)，并在室温下搅拌反应混合物16小时。在减压下浓缩反应混合物并用乙酸乙酯(20mL)稀释残余物。用水(2次，每次5mL)、盐水(5mL)洗涤，并用Na2SO4干燥。过滤，随后在减压下浓缩，得到粗品3(2g，55.5％)，其不经进一步纯化即用于下一步骤中。
步骤2
向经搅拌的3(2g，7.57mmol)于浓HCl(20mL)中的溶液中分数小份添加SnCl2(7.5g，34.06mmol)。在50℃下搅拌反应混合物2小时并用NaHCO3碱化。用乙酸乙酯萃取3次，每次25mL，用水(5mL)、盐水溶液(5mL)洗涤，并用无水Na2SO4干燥。过滤，随后在减压下浓缩，得到深褐色固体状的4(1.65g，93％)，其以原样用于下一步骤中。
实例99
制备N-(4-(5-氟-2-(3-(2-(2-氧代吡咯烷-1-基)乙氧基)苯基氨基)嘧啶-4-基氧基)苯甲基)-N-甲基丙烯酰胺I-146
根据实例98中所述的方案、步骤和中间物，在步骤1中使用(4-羟苯甲基)(甲基)氨基甲酸叔丁酯代替2，并在步骤2中使用3-(2-(2-氧代吡咯烷-1-基)乙氧基苯胺代替4，来制备标题化合物。1H NMR(CDCl3)δppm:2.03(五重峰,J＝7.4Hz,2H),2.39(t,J＝8Hz,2H),3.07&3.06(s,总共3H),3.57(t,J＝6.96Hz,2H),3.66(t,J＝5.08Hz,2H),4.03-4.04(bd,J＝4.96Hz,2H),4.67&4.72(s,总共2H),5.70-5.85(m,1H),6.43(d,J＝16.72Hz,1H),6.50(d,J＝5.72Hz,1H),6.60-6.75(m,1H),6.89-6.96(m,2H),7.06-7.08(m,2H),7.18-7.30(m,2H),7.37(d,J＝8.44Hz,1H),8.21(d,J＝2.36Hz,1H)；LCMS:m/e506.2(M+1)。
实例100
制备N-(4-(5-氟-2-(3-(3-(甲磺酰基)丙氧基)苯基氨基)嘧啶-4-基氧基)苯甲基)-N-甲基丙烯酰胺I-136
根据实例98中所述的方案、步骤和中间物，在步骤1中使用(4-羟基苯甲基)(甲基)氨基甲酸叔丁酯代替2，并在步骤2中使用3-(3-(3-甲磺酰基)丙氧基苯胺代替4，来制备标题化合物。1H NMR(CDCl3)δppm:2.25-2.40(m,2H),2.97(s,3H),3.07(s,3H),3.20-3.30(m,2H),3.98-4.05(m,2H),4.67(s,1H),4.72(s,1H),5.7-5.82(m,1H),6.43(dd,J＝1.96&16.96Hz,1H),6.49-6.53(m,1H),6.6-6.75(m,1H),6.85-7.00(m,2H),7.05-7.15(m,2H),7.18-7.25(m,2H),7.36(d,J＝8.36Hz,1H),8.21(bd,J＝2.52Hz,1H)；LCMS:m/e 515.0(M+1)。
实例101
制备N-(4-(5-氟-2-(6-甲氧基吡啶-3-基氨基)嘧啶-4-基氧基)苯甲基)-N-甲基丙烯酰胺I-117
根据实例98中所述的方案、步骤和中间物，在步骤1中使用(4-羟基苯甲基)(甲基)氨基甲酸叔丁酯代替2，并在步骤2中使用6-甲氧基-3-氨基吡啶代替4，来制备标题化合物。1H NMR(DMSO-d6)δppm:2.92&3.07(s,总共3H),3.76(s,3H),4.62&4.74(s,总共2H),5.69&5.75(dd,J＝1.6&10.4Hz,总共1H),6.20(dd,J＝1.2&16.4Hz,1H),6.56(d,J＝8.8Hz,1H),6.82-6.90(m,1H),7.28-7.35(m,4H),7.71(bd,J＝7.6Hz,1H),8.14(s,1H),8.44(bd,J＝2.8Hz,1H),9.48(s,1H)；LCMS:m/e 410(M+1)。
实例102
制备N-(4-(5-氟-2-(3-(3-(2-氧代吡咯烷-1-基)丙氧基)苯基氨基)嘧啶-4-基氧基)苯甲基)-N-甲基丙烯酰胺I-111
根据实例98中所述的方案、步骤和中间物，在步骤1中使用(4-羟基苯甲基)(甲基)氨基甲酸叔丁酯代替2，并在步骤2中使用3-(3-(2-氧代吡咯烷-1-基)丙氧基)苯胺代替4，来制备标题化合物。1H NMR(DMSO-d6)δppm:1.80-2.6(m,4H),2.20(t,J＝7.6Hz,2H),2.92&3.06(s,总共3H),3.20-3.40(m,4H),3.75-3.90(m,2H),4.62&4.73(s,总共2H),5.65-5.77(m,1H),6.20(dd,J＝2.4&16.8Hz,1H),6.24(bd,J＝8Hz,1H),6.86(dd,J＝10.4&16.8Hz,1H),6.93(t,J＝8Hz,1H),7.08(t,J＝8Hz,2H),7.28-7.36(m,4H),8.48(d,J＝2.8Hz,1H),9.51(s,1H)；LCMS:m/e 520.2(M+1)。
实例103
制备N-(3-(5-氟-2-(3-(2-(2-氧代吡咯烷-1-基)乙氧基)苯基氨基)嘧啶-4-基氧基)苯基)丙烯酰胺I-184
根据下文所述的方案、步骤和中间物制备标题化合物。
A))K2CO3，DMF，室温，16小时；B)Pd(OAc)2，BINAP，Cs2CO3，甲苯，100℃，8小时；C)Pd-C，H2，甲醇，室温，16小时。D))丙烯酰氯，K2CO3，NMP，0℃，30分钟。
步骤1
向经搅拌的1(24g，143.7mmol)和K2CO3(20g，143.6mmol)于无水DMF(300mL)中的溶液中添加2(10g，71.8mmol)，并在室温下，于氮气氛围下搅拌反应混合物16小时。冷却反应混合物，并用水(600mL)淬灭。通过经布氏漏斗过滤来分离沉淀析出的白色固体，并真空干燥，得到白色固体状的3(13g，68％)。
步骤2
向3(0.9g，3.3mmol)于甲苯(30mL)中的溶液中添加4(950mg，4.3mmol)，随后添加BINAP(0.12g，0.19mmol)、乙酸钯(0.02g，0.09mmol)和Cs2CO3(2.7g，8.2mmol)。搅拌反应混合物，并向其中鼓入氮气，持续15分钟。随后在100℃下，于氮气氛围下将其加热8小时。将反应混合物冷却到室温，用乙酸乙酯(60mL)稀释，用水(35mL)、盐水(35mL)洗涤，并用Na2SO4干燥。在减压下浓缩，得到残余物，借助管柱色谱法(SiO2，60-120，以甲醇/氯仿：8/92洗脱产物)纯化残余物，得到白色固体状的5(0.50g，33％)。
步骤3
向5(0.5g，1.1mmol)于甲醇(50mL)中的溶液中添加10％Pd/C(0.05g，以重量比计10％)，并在室温下，于氢气氛围(1.5Kg氢气压力)下搅拌反应混合物16小时。反应混合物经celite垫过滤，并在减压下浓缩，得到无色粘稠液体状的6(0.3g，65％)。
步骤4
在0℃下，向经搅拌的6(0.21g，0.5mmol)和碳酸钾(0.27g，2.0mmol)于NMP(2.5mL)中的溶液中添加丙烯酰氯(0.053g，0.6mmol)，并在0℃下搅拌反应混合物30分钟。将反应混合物逐滴添加到搅拌的冷10％NaHCO3溶液中，并在相同温度(0℃)下搅拌30分钟。通过经布氏漏斗过滤分离出沉淀析出的白色固体。用冷水和己烷洗涤固体，并将其溶解于甲醇/二氯甲烷混合物(50:50，10mL)中，且在减压下浓缩。将得到的残余物悬浮于冷水(25mL)中，向其中添加Et3N，并用乙酸乙酯萃取2次，每次50mL。用水(50mL)、盐水(50mL)洗涤合并的乙酸乙酯萃取物，用Na2SO4干燥并在减压下浓缩，得到白色固体状的I-184(0.150g，65％)。1H NMR(DMSO-d6)δppm:1.89(五重峰,J＝7.2Hz,2H),2.21(t,J＝7.6Hz,2H),3.39(t,J＝7.2Hz,2H),3.49(t,J＝5.2Hz,2H),3.87(t,J＝5.6Hz,2H),5.77(dd,J＝1.6&10.4Hz,1H),6.26(dd,J＝1.6&17.2Hz,1H),6.39-6.46(m,2H),6.95(t,J＝8.4Hz,1H),7.03-7.12(m,3H),7.44(t,J＝8.4Hz,1H),7.56(d,J＝8.4Hz,1H),7.70(s,1H),8.51(d,J＝2.8Hz,1H),9.56(s,1H),10.35(s,1H)；LCMS:m/e 478(M+1)。
根据下文所示的方案制备中间物3-(2-(2-氧代吡咯烷-1-基)乙氧基苯胺4。
A)NaH，THF，室温，16小时；B)Pd-C，H2，甲醇，室温，16小时。
步骤1
在0℃下，向搅拌的NaH(3.4g，141.6mmol，60％于石蜡油中的分散液)于无水THF(50mL)中的溶液中添加1(6g，46.0mmol)，并在室温下，于氮气氛围下搅拌反应混合物15分钟。向其中添加2(5.0g，35.4mmol)于THF(10mL)中的溶液，并在室温下搅拌反应混合物16小时。用冷水(40mL)对其进行淬灭，并用乙酸乙酯(35mL)萃取。用水(2次，每次25mL)、盐水(25mL)洗涤乙酸乙酯萃取物，用Na2SO4干燥并在减压下浓缩，得到残余物，借助管柱色谱法(SiO2，60-120，以甲醇/氯仿：10/90洗脱产物)纯化，得到微褐色液体状的3(2.5g，30％)。
步骤2
向3(2.2g，8.8mmol)于甲醇(50mL)中的溶液中添加10％Pd/C(0.22g，以重量比计10％)，并在室温下，于氢气氛围(1.5Kg氢气压力)下搅拌反应混合物16小时。反应混合物经垫过滤，并在减压下浓缩，得到微黄色液体状的4(1.7g，89％)。其不经进一步纯化即用于下一步骤中。
实例104
制备N-(3-(2-(6-甲氧基吡啶-3-基氨基)-5-甲基嘧啶-4-基氧基)苯基)丙烯酰胺I-186
根据实例103中所述的方案、步骤和中间物，在步骤1中使用2,4-二氯-5-甲基嘧啶代替1，并在步骤2中使用6-甲氧基-3-氨基吡啶代替4，来制备标题化合物。1H NMR(DMSO-d6)δppm:2.16(s,3H),3.73(s,3H),5.76(dd,J＝1.92&10.04Hz,1H),6.24(dd,J＝1.92&16.92Hz,1H),6.39-6.49(m,2H),6.92(dd,J＝1.48&8Hz,1H),7.40(t,J＝8.08Hz,1H),7.49(d,J＝8.16Hz,1H),7.64(d,J＝1.84Hz,1H),7.77-7.79(m,1H),8.17(bs,1H),8.20(s,1H),9.27(s,1H),10.29(s,1H)；LCMS:m/e 378(M+1)。
实例105
制备N-(3-(5-甲基-2-(苯基氨基)嘧啶-4-基氧基)苯基)丙烯酰胺I-248
根据下文所述的方案、步骤和中间物制备标题化合物。
A)K2CO3，DMF，室温，24小时；A')(Boc)2O，THF，60℃，2小时；B)苯胺，浓HCl，EtOH，80℃，1小时；C)TFA，CH2Cl2，0℃到室温，半小时；D)丙烯酰氯，NMP，0℃，10分钟。
步骤1
向搅拌的2(100mg，0.48mmol)和K2CO3(99.2mg，0.717mmol)于无水DMF(5mL)中的溶液中添加1(78mg，0.478mmol)，并在室温下，于氮气氛围下搅拌反应混合物24小时。在减压下浓缩反应混合物并用乙酸乙酯(10mL)稀释残余物。用水(2次，每次5mL)、盐水(5mL)洗涤，用Na2SO4干燥，并在减压下浓缩，得到白色固体状的3(120mg，75％)。其不经进一步纯化即用于下一步骤中。
步骤2
向压力管中装入3(75mg，0.224mmol)、浓HCl(40mg，0.4mmol)、苯胺(83mg，0.89mmol)和乙醇(2.0mL)。将所述管的螺旋帽旋紧，并在80℃下搅拌内含物60分钟。冷却反应混合物，在减压下浓缩并用水(5.0mL)淬灭残余物。用10％NaHCO3溶液碱化，并用乙酸乙酯萃取3次，每次10mL。用水(2次，每次5mL)、盐水(5mL)洗涤合并的EtOAc层，用Na2SO4干燥并在减压下浓缩。借助管柱色谱法(SiO2，60-120目，EtoAc/己烷：50/50)进一步纯化得到的残余物，得到灰白色固体状的4(0.04g，45.9％)。
步骤3
在0℃下，向搅拌的4(160mg，0.40mmol)于二氯甲烷(4.0mL)中的溶液中添加三氟乙酸(0.8mL)。在相同温度下持续搅拌30分钟，随后在减压下浓缩反应混合物，并将残余物溶解于水(5.0mL)中，用10％NaHCO3溶液碱化，并用二氯甲烷萃取2次，每次5mL。用水(5mL)、盐水(5mL)洗涤二氯甲烷萃取物，用Na2SO4干燥并在减压下浓缩，得到灰白色固体状的5(110mg，93.2％)。其不经进一步纯化即用于下一步骤中。
步骤4
在0℃下，向经搅拌的5(75mg，0.256mmol)于NMP(0.8mL)中的溶液中添加丙烯酰氯(34.8mg，0.38mmol)，并在0℃下搅拌反应混合物10分钟。用水(4.0mL)淬灭反应混合物，用10％NaHCO3溶液碱化，并用二氯甲烷萃取2次，每次5mL。用水(5mL)、盐水(5mL)洗涤二氯甲烷萃取物，用Na2SO4干燥并在减压下浓缩。借助管柱色谱法(SiO2，60-120目，CHCl3/MeOH：99/1)进一步纯化得到的残余物，得到无色固体状的I-248(0.035g，39.6％)。1H NMR(DMSO-d6)δppm:2.15(s,3H),5.75(dd,J＝1.92&10.04Hz,1H),6.24(dd,J＝1.96&16.96Hz,1H),6.41(dd,J＝10.6&17Hz,1H),6.78-6.8(m,1H),6.94(dd,J＝1.44&8.04Hz,1H),7.00(t,J＝7.52Hz,2H),7.40-7.44(m,3H),7.53(d,J＝8.24Hz,1H),7.6(t,J＝2Hz,1H),8.23(d,J＝1.04Hz,1H),9.36(s,1H),10.30(s,1H)；LCMS:m/e 346.8(M+1)。
实例106
制备1-(4-(5-氟-2-(苯基氨基)嘧啶-4-基氨基)哌啶-1-基)丙-2-烯-1-酮I-229
根据实例20中所述的方案、步骤和中间物，在步骤1中使用1-叔丁氧羰基-4-氨基哌啶代替2并在步骤2中使用苯胺代替4，来制备标题化合物。1H NMR(DMSO-d6)δppm:1.35-1.50(m,2H),1.90-2.05(m,2H),2.7-2.85(m,1H),3.10-3.20(m,1H),4.11-4.15(m,2H),4.46(bd,J＝13.72Hz,1H),5.67(dd,J＝2.44&10.4Hz,1H),6.10(dd,J＝2.44&16.6Hz,1H),6.82-6.88(m,2H),7.22(t,J＝7.44Hz,2H),7.35(d,J＝7.56Hz,1H),7.70(d,J＝7.72Hz,2H),7.87(d,i＝3.76Hz,1H),9.07(s,1H)；LCMS:m/e 341.383(M+1)。
实例107
制备2-((3-(5-氟-2-(4-(2-甲氧基乙氧基)苯基氨基)嘧啶-4-基氨基)苯基)(羟基)甲基)丙烯腈I-71
根据下文所述的方案、步骤和中间物制备标题化合物。
A)2，DIPEA，n-BuOH，120℃，12小时；B)浓HCl，乙醇，100℃，5小时；C)LiOH，MeOH/THF/H2O，室温，6小时；D)Me-NH-OMe.HCl，EDCI.HCl，HOBT，DIPEA，DMF，室温，8小时；E)LAH(1.0M的THF溶液)，-78℃，30分钟；F)DABCO，1,4-二噁烷/水，室温，48小时。
步骤1
在压力管中，加热1(0.50g，2.99mmol)、2(0.45g，2.99mmol)和DIPEA(0.57g，4.48mmol)于正丁醇(5.0mL)中的溶液(120℃，16小时)。将其冷却，用水(5mL)淬灭，并用EtOAc萃取2次，每次5mL。用水(2mL)、盐水(2mL)洗涤合并的EtOAc萃取物，用Na2SO4干燥并在减压下浓缩，得到灰白色固体状的3(0.70g，83.3％)。
步骤2
将3(0.5g，1.77mmol)和4(0.29g，1.77mmol)于乙醇(2.5mL)中的溶液装入压力管中，并向其中添加乙酸(0.1mL)。紧密封闭所述管，并在100℃下搅拌内含物5小时。冷却反应混合物，在减压下去除乙醇并将残余物溶解于乙酸乙酯(50mL)中。用NaHCO3溶液(5mL)、盐水(5mL)洗涤，用Na2SO4干燥并在减压下浓缩。通过过滤分离出沉淀的固体。在真空下干燥，得到5(0.6g，80％)。
步骤3
向经搅拌的5(0.6g，1.4mmol)于甲醇/THF/水：6mL/6mL/3mL中的溶液中添加LiOH(0.298g，7mmol)，并在室温下搅拌反应混合物2小时。在减压下浓缩反应混合物；用水(2mL)稀释残余物，并用乙醚(5mL)萃取。分离水层，并用1.5N HCl(pH值为约4-5)酸化，浓缩并在真空下干燥，得到白色固体状的6(0.4g，70％)，其不经进一步纯化即用于下一步骤。
步骤4
向经搅拌的6(0.4g，1mmol)于DMF(3mL)中的溶液中添加MeNH-OMe.HCl(0.102g，0.1mmol)、EDCI.HCl(0.003g、1.5mmol)、HOBT(71mg，0.5mmol)和DIPEA(0.204g，1.5mmol)。在室温下搅拌反应混合物8小时，并用水淬灭，且用EtOAc萃取2次，每次5mL。用盐水洗涤合并的有机层，用无水Na2SO4干燥，过滤并在减压下浓缩，得到白色固体状的7(0.4g，90.9％)。
步骤5
在-78℃下，向经搅拌的7(0.4g，0.9mmol)于THF(10mL)中的溶液中添加LAH(1.8mL，1.8mmol)。在相同温度下搅拌反应混合物30分钟，随后用Na2SO4溶液(2mL)淬灭反应，并用乙酸乙酯(10mL)萃取。分离乙酸乙酯层，并用水(2mL)、盐水溶液(2mL)洗涤，并用无水Na2SO4干燥。过滤，随后在减压下浓缩，得到残余物，借助管柱色谱法(SiO2，60-120，石油醚/乙酸乙酯7/3)纯化，得到黄色固体状的8(200mg，58％)。
步骤6
在室温下，向经搅拌的8(200mg，0.523mmol)和9(69mg，1.3mmol)于1,4-二噁烷/H2O(1.4mL/0.6mL)中的溶液中添加DABCO(50mg，0.2523mmol)。在室温下持续搅拌48小时，随后在减压下浓缩反应混合物。借助管柱色谱法(SiO2，石油醚/乙酸乙酯，6/4)进一步纯化得到的残余物，得到带绿色的粘性物质I-71(0.05g，22.7％)。1H NMR(DMSO-d6)δppm:3.48(s,3H),3.77(t,J＝4.4Hz,2H),4.11-4.16(m,2H),5.11(s,1H),5.99(s,1H),6.06(s,1H),6.85(s,1H),6.91(d,J＝8.84Hz,2H),7.15(d,J＝7.44Hz,1H),7.30-7.40(m,；LCMS:m/e(M+1)。
实例108
制备2-((4-(5-氟-2-(苯基氨基)嘧啶-4-基氨基)苯基)(羟基)甲基)丙烯腈I-161
根据实例107中所述的方案、步骤和中间物，在步骤2中使用苯胺代替4，来制备标题化合物。1H NMR(CDCl3)δppm:5.32(s,1H),6.07(d,J＝0.8Hz,1H),6.15(d,J＝1.6Hz,1H),6.84(d,J＝2.8Hz,1H),7.03-7.06(m,2H),7.29(t,J＝1.6Hz,2H),7.38(d,J＝8.44Hz,2H),7.52(d,J＝8.8Hz,2H),7.67(dd,J＝1.6&6.4Hz,2H),7.96(d,J＝3.2Hz,1H)；LCMS:m/e361.8(M+1)。
实例109
制备2-((4-(5-氟-2-(3-三氟甲氧基苯基氨基)嘧啶-4-基氨基)苯基)(羟基)甲基)丙烯腈I-163
根据实例107中所述的方案、步骤和中间物，在步骤2中使用3-三氟甲氧基苯胺代替4，来制备标题化合物。1H NMR(DMSO-d6)δppm:5.29(d,J＝3.8Hz,1H),6.13(s,1H),6.19(s,1H),6.31(dd,J＝3.8Hz,1H),6.83(d,J＝7.76Hz,1H),7.11(d,J＝7.8Hz,1H),7.30-7.37(m,2H),7.61-7.63(m,2H),7.81(s,1H),7.90(d,J＝7.4Hz,1H),8.16(dd,J＝1.44&3.56Hz,1H),9.45(s,1H),9.53(s,1H)；LCMS:m/e 446(M+1)。
实例110
制备N-(3-(5-氟-2-(3-(3-(甲磺酰基)丙氧基)苯基氨基)嘧啶-4-基氧基)苯基)丙烯酰胺I-116
根据实例98中所述的方案、步骤和中间物，在步骤2中使用3-(3-甲磺酰基)丙氧基苯胺代替4，来制备标题化合物。1H NMR(DMSO-d6)δppm:2.02-2.15(m,2H),3.01(s,3H),3.22(t,J＝7.56Hz,2H),3.88(t,J＝6.12Hz,2H),5.77(dd,J＝1.84&10.12Hz,1H),6.25(dd,J＝1.72&16.88Hz,1H),6.43(d,J＝9.96&16.76Hz,2H),6.95(t,J＝8.12Hz,1H),7.06(t,J＝7.48Hz,2H),7.13(s,1H),7.44(t,J＝8.12Hz,1H),7.56(d,J＝8.44Hz,1H),7.68(s,1H),8.50(d,J＝2.84Hz,1H),9.57(s,1H),10.34(s,1H)；LCMS:m/e 487.0(M+2)。
实例111
制备N-(3-(5-环丙基-2-(4-(2-甲氧基乙氧基)苯基氨基)嘧啶-4-基氧基)苯基)丙烯酰胺I-131
根据下述步骤和中间物制备标题化合物。
A)K2CO3，DMA，室温，5小时；B)PTSA，二噁烷，100℃，2小时；C)环丙基三氟硼酸钾，Pd(OAc)2，Xanphos，Cs2CO3，甲苯，100℃，12小时；D)4N HCL，二噁烷，室温，1小时；随后丙烯酰氯，Et3N，DCM，-10℃，10分钟
步骤1
向5-溴-2,4-二氯嘧啶(0.68g，3.0mmol)和3-羟基苯基氨基甲酸叔丁酯(0.65g，3.1mmol)于DMA(4mL)中的溶液中添加K2CO3(0.83g，6.0mmol)。搅拌悬浮液5小时。添加水(15ml)并借助过滤收集沉淀物。用乙醚洗涤固体，并干燥，得到1.2g化合物3。MS:m/e＝400.2,402.2(M+1)。
步骤2
向化合物3(200mg，0.5mmol)和4-(2-甲氧基乙氧基)苯胺(0.1g，0.6mmol)于5ml二噁烷中的溶液中添加单水合4-甲基苯磺酸(0.08g，0.4mmol)。在100℃下搅拌混合物2小时。蒸发溶剂。将残余物溶解于20ml乙酸乙酯中，并用NaHCO3水溶液、水和盐水洗涤。分离有机层，并用Na2SO4干燥。去除溶剂后，用硅胶对粗产物进行色谱分离(己烷:EtOAc＝1:1)。得到0.10g化合物5：MS m/z:531.1,531.0(M+H+)。
步骤3
将环丙基三氟硼酸钾(36mg，0.25mmol)、化合物5(0.10g，0.19mmol)、乙酸钯(3.4mg，0.015mmol)、Xantphos(17.5mg，0.03mmol)和Cs2CO3(186mg，0.57mmol)悬浮于5mL甲苯和1mL水中。使混合物脱气，在氩气下密封，并在100℃下加热12小时。添加20mL乙酸乙酯，并用NaHCO3水溶液、水和盐水洗涤。分离有机层，并用Na2SO4干燥。去除溶剂后，用硅胶对粗产物进行色谱分离(己烷:EtOAc＝1:1)。得到50mg化合物6：MS m/z:493.2(M+H+)。
步骤4
根据实例96中所述的程序，由化合物6制备标题化合物。MS m/z:447.1(M+H+)。
实例112
制备1-(4-(5-氟-2-(3-(2-二甲基氨基乙氧基)苯基氨基)嘧啶-4-基氨基)苯基)-2-甲基丙-2-烯-1-酮I-207
根据下文所述的方案、步骤和中间物制备标题化合物。
A)2，DIPEA，n-BuOH，90℃，12小时；B)4，Pd(OAc)2，BINAP，Cs2CO3，甲苯，110℃，16小时；C)LiOH，MeOH/THF/H2O，室温，6小时；D)MeNHOMe.HCl，EDCI.HCl，HOBT，DIPEA，DMF，室温，3小时；E)8，THF，0℃到室温，2小时。
步骤1
在压力管中，加热1(4g，23.9mmol)、2(3.6g，23.7mmol)和DIPEA(4.6g，35.58mmol)于正丁醇(40mL)中的溶液(90℃，12小时)。将其冷却，用水(5mL)淬灭，并用EtOAc萃取2次，每次5mL。用水(60mL)、盐水(40mL)洗涤合并的EtOAc萃取物，用Na2SO4干燥并在减压下浓缩，得到灰白色固体状的3(5.5g，82％)。
步骤2
在110℃下，于氮气氛围下将4(0.319g，1.76mmol)、3(0.5g，1.76mmol)、Pd(OAc)2(0.039g，0.17mmol)、BINAP(0.055g，0.08mmol)和Cs2CO3(1.44g，4.42mmol)于经过脱气的甲苯(用氮气净化甲苯30分钟)中的溶液加热16小时。冷却反应混合物，用EtOAc(25mL)稀释，并用水(5mL)、盐水(2mL)洗涤，并且用Na2SO4干燥。过滤，随后在减压下浓缩，得到残余物，借助管柱色谱法(SiO2，60-120，；氯仿/甲醇，9/1)进一步纯化残余物，得到黄色固体状的4(0.63g，84％)。
步骤3
向经搅拌的5(0.3g，0.70mmol)于甲醇/THF/水：1mL/1mL/0.5mL中的溶液中添加LiOH(0.147g，3.52mmol)，并在室温下搅拌反应混合物6小时。在减压下浓缩反应混合物；用水(2mL)稀释残余物，并用乙醚(5mL)萃取。分离水层，并用1.5N HCl(pH值为约4-5)酸化，以原样浓缩，并在真空下干燥，得到黄色粘性固体状的6(0.31g，粗品)，其不经进一步纯化即用于下一步骤。
步骤4
向经搅拌的6(0.29g，0.70mmol)于DMF(3mL)中的溶液中添加MeNH-OMe.HCl(0.068g，0.70mmol)、EDCI.HCl(0.202g、1.05mmol)、HOBT(0.047g，0.35mmol)和DIPEA(0.136g，1.05mmol)。在室温下搅拌反应混合物3小时，用水淬灭，并用EtOAc萃取2次，每次5mL。用盐水洗涤合并的有机层，用无水Na2SO4干燥，过滤并在减压下浓缩。借助管柱色谱法(SiO2，60-120，甲醇/氯仿：20/80)进一步纯化残余物，得到粘性黄色固体状的7(0.061g，19％)。
步骤5
在0℃下，向经搅拌的7(100mg，0.22mmol)于THF(1mL)中的溶液中添加8(17.6mL，8.80mmol)。在室温下搅拌反应混合物2小时。用饱和NH4Cl溶液(0.5mL)淬灭反应混合物，并用EtOAc萃取2次，每次3mL。用盐水洗涤合并的有机层，用无水Na2SO4干燥，过滤并在减压下浓缩，得到白色固体。借助管柱色谱法(SiO2，60-120，以20％甲醇/氯仿洗脱产物)对其进行进一步纯化，得到粘性黄色固体状的I-207(9mg.9％)。1H NMR(DMSO-d6)δppm:1.90(s,3H),2.01(s,3H),2.19(s,6H),2.57(t,J＝5.64Hz,2H),3.87(t,J＝5.84Hz,2H),6.45(dd,J＝1.64&8.08Hz,1H),6.82(s,1H),7.04(t,J＝8.16Hz,1H),7.18(d,J＝8.16Hz,1H),7.33(s,1H),7.47(t,J＝7.88Hz,1H),7.62(d,J＝7.72Hz,1H),8.13-8.16(m,3H),9.24(s,1H),9.56(s,1H)；LCMS:m/e 450.1(M+1)。
实例113
制备1-(4-(5-氟-2-(苯基氨基)嘧啶-4-基氨基)苯基)-3-甲基丁-2-烯-1-酮I-206
根据实例112中所述的方案、步骤和中间物，在步骤1中使用4-氨基苯甲酸甲酯代替2并在步骤2中使用苯胺代替4，来制备标题化合物。1H NMR(DMSO-d6)δppm:1.98(s,3H),2.12(s,3H),6.90-7.00(m,2H),7.20-7.30(m,2H),7.65(d,J＝8.16Hz,2H),7.90(d,J＝8.56Hz,2H),7.98(d,J＝8.68Hz,2H),8.18(bs,1H),9.31(s,1H),9.68(s,1H)；LCMS:m/e363.0(M+1)。
实例114
制备1-(3-(5-氟-2-(3-(丙-2-炔基氧基)苯基氨基)嘧啶-4-基氨基)苯基)-3-甲基丁-2-烯-1-酮I-211
根据实例112中所述的方案、步骤和中间物，在步骤2中使用3-丙-2-炔基氧基苯胺代替4，来制备标题化合物。1H NMR(CD3OD)δppm:2.0(d,J＝1Hz,3H),2.21(d,J＝1.04Hz,3H),2.94-2.96(d,J＝2.44Hz,1H),4.59(d,J＝2.36Hz,2H),6.79-6.81(m,2H),7.03(dd,J＝3.12&8.04Hz,1H),7.14(t,J＝2.2Hz,1H),7.23(t,J＝8.12Hz,1H),7.54(t,J＝7.92Hz,1H),7.83(d,J＝7.96Hz,1H),7.86(dd,J＝2.08&8.08Hz,1H),8.03(d,J＝4.96Hz,1H),8.21(t,J＝1.88Hz,1H)；LCMS:m/e 417.0(M+1)。
实例115
制备1-(3-(5-氟-2-(3-(三氟甲氧基)苯基氨基)嘧啶-4-基氨基)苯基)-3-甲基丁-2-烯-1-酮I-223
根据实例112中所述的方案、步骤和中间物，在步骤2中使用3-三氟甲氧基苯胺代替4，来制备标题化合物。1H NMR(CDCl3)δppm:2.0(d,J＝1.08Hz,3H),2.24(d,J＝1.04Hz,3H),6.74(t,J＝1.24Hz,1H),6.85(dd,J＝1.08&7.0Hz,1H),6.90(s,1H),7.08(s,1H),7.24-7.28(m,1H),7.35(td,J＝1.2&7.44Hz,1H),7.49(t,J＝7.88Hz,1H),7.63(s,1H),7.72(td,J＝1.04&7.76Hz,1H),7.90-7.92(m,1H),8.00-8.05(m,2H)；LCMS:m/e447(M+1)。
实例116
制备1-(3-(5-氟-2-(3-(三氟甲氧基)苯基氨基)嘧啶-4-基氨基)苯基)-2-甲基丙-2-烯-1-酮I-199
根据实例112中所述的方案、步骤和中间物，在步骤2中使用3-三氟甲氧基苯胺代替4，并在步骤5中使用溴化异丙烯基镁代替8，来制备标题化合物。1H NMR(DMSO-d6)δppm:1.97(s,3H),5.6(s,1H),6.0(d,J＝0.96Hz,1H),6.82(d,J＝8.08Hz,1H),7.27(t,J＝8.2Hz,1H),7.41(dd,J＝1.12&7.56Hz,1H),7.48(t,J＝7.76Hz,1H),7.60(dd,J＝1.28&7.88Hz,1H),7.78(s,1H),7.90(d,J＝1.64Hz,1H),8.15(d,J＝8Hz,1H),8.19(d,J＝3.64Hz,1H),9.55(s,1H),9.65(s,1H)；LCMS:m/e 433(M+1)。
实例117
制备1-(4-(5-氟-2-(苯基氨基)嘧啶-4-基氨基)苯基)-2-甲基丙-2-烯-1-酮I-185
根据实例112中所述的方案、步骤和中间物，在步骤1中使用4-氨基苯甲酸甲酯代替2，在步骤2中使用苯胺代替4，并在步骤5中使用溴化异丙烯基镁代替8，来制备标题化合物。1H NMR(DMSO-d6)δppm:1.99(s,3H),5.54(s,1H),1.01(s,1H),6.93(t,J＝7.36Hz,1H),7.24(t,J＝7.52Hz,2H),7.66-7.72(m,4H),8.01(d,J＝8.72Hz,2H),8.19(d,J＝3.6Hz,1H),9.32(s,1H),9.72(s,1H)；LCMS:m/e 348.8(M+1)。
实例118
制备N-(3-(2-(3-(2-(二甲基氨基)乙氧基)苯基氨基)-5-氟嘧啶-4-基氨基)苯基)丙烯酰胺I-233
根据实例20中所述的步骤、方案和中间物，在步骤2中使用3-(2-二甲基氨基乙氧基)苯胺代替4，来制备标题化合物。1H NMR(CD3OD)δppm:2.31(s,6H),2.76(t,J＝5.6Hz,2H),3.97(t,J＝5.2Hz,2H),5.78(dd,J＝2&9.2Hz,1H),6.38-6.42(m,2H),6.52-6.55(m,1H),7.1-7.11(m 2H),7.30(t,J＝8.0Hz,1H),7.36(s,1H),7.42-7.48(m,2H),7.94(d,J＝3.6Hz,1H),8.05(s,1H)；LCMS:m/e 437(M+1)。
实例119
制备N-(3-(5-氟-4-(4-苯氧基苯氧基)嘧啶-2-基氨基)苯基)丙烯酰胺I-130
根据实例11中所述的步骤、方案和中间物，在步骤1中使用5-氟-2,4-二氯嘧啶代替1，来制备标题化合物。1H NMR(DMSO-d6)δppm:5.71(dd,J＝1.6&10Hz,1H),6.22(dd,J＝1.6&16.8Hz,1H),6.44(dd,J＝10.4&17.2Hz,1H),6.98-7.05(m,3H),7.1-7.12(m,2H),7.17(t,J＝7.2Hz,1H),7.24(t,J＝7.6Hz,2H),7.35-7.37(m,2H),7.42(t,J＝8.4Hz,2H),7.71(s,1H),8.5(s,1H),9.6(s,1H),10.05(s,1H)；LCMS:m/e 443.0(M+1)。
实例120
制备(S)-N-(3-(5-氟-2-(4-(四氢呋喃-3-基氧基)苯基氨基)嘧啶-4-基氨基)苯基)丙烯酰胺I-43
根据实例20中所述的步骤、方案和中间物，在步骤2中使用(S)-4-(四氢呋喃-3-基氧基苯胺代替4，来制备标题化合物。1H NMR(DMSO-d6,500MHz):δ10.10(s,1H),9.35(s,1H),8.95(s,1H),8.05(d,J＝4.0Hz,1H),7.92(s,1H),7.52(d,J＝9.0Hz,2H),7.47(d,J＝7.5Hz,1H),7.41(d,J＝8.5Hz,1H),7.27(t,J＝8.0Hz,1H),6.72(d,J＝9.0Hz,2H),6.45(dd,J＝1.5,17.0Hz,1H),6.25(dd,J＝1.1,16.5Hz,1H),5.75(dd,J＝1.1,10.0Hz,1H),4.93-4.84(m,1H),3.88-3.72(m,4H),2.20-2.10(m,1H),1.97-1.90(m,1H)。MS m/e＝436[M++1]
实例121
制备(R)-N-(3-(5-氟-2-(4-(四氢呋喃-3-基氧基)苯基氨基)嘧啶-4-基氨基)苯基)丙烯酰胺I-46
根据实例20中所述的步骤、方案和中间物，在步骤2中使用(R)-4-(四氢呋喃-3-基氧基苯胺代替4，来制备标题化合物。1H NMR(DMSO-d6,500MHz):δ10.10(s,1H),9.35(s,1H),8.95(s,1H),8.05(d,J＝4.0Hz,1H),7.92(s,1H),7.52(d,J＝9.0Hz,2H),7.47(d,J＝7.5Hz,1H),7.41(d,J＝8.5Hz,1H),7.27(t,J＝8.0Hz,1H),6.72(d,J＝9.0Hz,2H),6.45(dd,J＝1.5,17.0Hz,1H),6.25(dd,J＝1.1,16.5Hz,1H),5.75(dd,J＝1.1,10.0Hz,1H),4.93-4.84(m,1H),3.88-3.72(m,4H),2.22-2.14(m,1H),1.97-1.90(m,1H)。MS:m/e＝436[M++1]
实例122
制备N-(3-(5-氟-2-(3-((1-甲基哌啶-3-基)甲氧基)苯基氨基)嘧啶-4-基氨基)苯基)-丙烯酰胺I-76)
根据实例20中所述的步骤、方案和中间物，在步骤2中使用3-(1-甲基哌啶-3-基)甲氧基苯胺代替4，来制备标题化合物。1H NMR(DMSO-d6,500MHz):δ10.08(s,1H),9.41(s,1H),9.09(s,1H),8.11(d,J＝3.5Hz,1H),7.90(s,1H),7.57(d,J＝8.0Hz,1H),7.41(d,J＝8.0Hz,1H),7.32(s,1H),7.30-7.20(m,2H),7.03(t,J＝8.0Hz,1H),6.50-6.40(m,2H),6.24(dd,J＝1.5,17.0Hz,1H),5.74(dd,J＝2.0,10.5Hz,1H),3.75-3.65(m,2H),2.73(d,J＝10Hz,1H),2.60(d,J＝10.5Hz,1H),2.13(s,3H),1.98-1.83(m,2H),1.75-1.58(m,3H),1.55-1.45(m,1H),1.05-0.95(m,1H)。MS:m/e＝477(M++1)。
实例123
制备N-(3-(5-氟-2-(3-((1-甲基哌啶-4-基)甲氧基)苯基氨基)嘧啶-4-基氨基)苯基)-丙烯酰胺I-82
根据实例20中所述的步骤、方案和中间物，在步骤2中使用3-(1-甲基哌啶-4-基)甲氧基苯胺代替4，来制备标题化合物。1H-NMR(CDCl3+DMSO-D6,500MHz):δ9.04(bs,1H),8.30(s,1H),7.96(s,1H),7.75(s,1H),7.63(s,1H),7.59(d,J＝7.0Hz,1H),7.38-7.33(m,2H),7.27(t,J＝8.5Hz,1H),7.16(t,J＝8Hz,1H),7.09(d,J＝8.5Hz,1H),6.52(d,J＝7.0Hz,1H),6.51-6.38(m,2H),5.73(dd,J＝2.0,9.0Hz,1H),3.77(d,J＝6.0Hz,2H),2.90-2.84(m,2H),2.28(s,3H),1.95(t,J＝10.0Hz,1H),1.85-1.74(m,2H),1.45-1.32(m,2H),1.28-1.25(m,2H)。MS:m/e＝477(M++1)。
实例124
制备N-(3-(2-(3-(4-(2-羟乙基)哌嗪-1-基)苯基氨基)-5-氟嘧啶-4-基氨基)苯基)丙烯酰胺I-83
根据实例20中所述的步骤、方案和中间物，在步骤2中使用3-(4-(2-叔丁基二甲基硅烷氧基乙基)哌嗪-1-基苯胺代替4，并将用含TFA的DCM脱除TBS醚的保护基作为步骤5，来制备标题化合物。1H NMR(DMSO-d6,500MHz):δ8.99(s,1H),8.85(s,1H),8.04(d,J＝4.0Hz,1H),7.28-7.19(m,2H),7.08-7.00(m,2H),6.94(t,J＝3.5Hz,2H),6.48(dd,J＝2.0,8.0Hz,1H),6.35-6.31(m,1H),4.94(s,2H),3.71(t,J＝6.0Hz,2H),3.02(t,J＝4.5Hz,4H),2.57-2.50(m,4H),2.46(t,J＝6.0Hz,2H),0.87(s,9H),0.05(s,6H)。MS:m/e＝538(M++1)。
实例125
制备N-(4-(5-氟-2-(3-甲氧基苯基氨基)嘧啶-4-基氨基)苯甲基)-N-甲基丙烯酰胺I-113
根据实例20中所述的步骤、方案和中间物，在步骤1中使用4-(N-甲基-N-叔丁氧羰基氨基)甲基苯胺代替2，并在步骤2中使用3-甲氧基苯胺代替4，来制备标题化合物。1H-NMR(DMSO-d6,200MHz):δ9.36(bs,1H),9.16(bs,1H),8.10(d,J＝3.4Hz,1H),7.83-7.70(m,2H),7.34(bs,1H),7.26-7.01(m,4H),6.86-6.73(m,1H),6.48(d,J＝8.0Hz,1H),6.21(dd,J＝16.4,2.2Hz,1H),5.76-5.64(m,1H),4.64-4.53(两个单峰,2H),3.65(s,3H),3.00-2.88(两个单峰,3H)。MS:m/e＝408.2[M++1]。
实例126
制备N-(4-(5-氟-2-(6-甲氧基吡啶-3-基氨基)嘧啶-4-基氨基)苯甲基)-N-甲基丙烯酰胺I-114
根据实例20中所述的步骤、方案和中间物，在步骤1中使用4-(N-甲基-N-叔丁氧羰基氨基)甲基苯胺代替2，并在步骤2中使用6-甲氧基-3-氨基吡啶代替4，来制备标题化合物。1H-NMR(DMSO-d6,200MHz):δ9.36(bs,1H),9.09(bs,1H),8.32(bs,1H),8.06(dd,J＝3.8Hz,1H),7.97-7.92(m,1H),7.76-7.68(m,2H),7.20-7.08(m,2H),6.87-6.75(m,1H),6.72(d,J＝8.4Hz,1H),6.22(dd,J＝19.4,2.6Hz,1H),5.74-5.65(m,1H),4.64-4.53(两个单峰,2H),3.78(s,3H),3.00-2.88(两个单峰,3H)。MS:m/e＝409(M++1)。
实例127
制备N-(3-(5-氟-2-(3-甲氧基苯基氨基)嘧啶-4-基氨基)苯甲基)-N-甲基丙烯酰胺I-115
根据实例20中所述的步骤、方案和中间物，在步骤1中使用3-(N-甲基-N-叔丁氧羰基氨基)甲基苯胺代替2，并在步骤2中使用3-甲氧基苯胺代替4，来制备标题化合物。1H-NMR(DMSO-d6,200MHz):δ9.50-9.30(m,1H),9.15-8.96(m,1H),8.15(bs,1H),7.82-7.59(m,2H),7.45-7.00(m,4H),6.97-6.65(m,2H),6.55-6.45(m,1H),6.26-6.12(m,1H),5.78-5.60(m,1H),4.68(s,1H),4.55&3.75(两个单峰,3H),2.90&3.00(两个单峰,3H)。MS:m/e＝408.2[M++1]。
实例128
制备N-(3-(5-氟-2-(3-(4-(2-羟乙基)哌嗪-1-基)苯基氨基)嘧啶-4-基氧基)苯基)丙烯酰胺I-84
根据实例98中所述的步骤、方案和中间物，在步骤2中使用3-(4-(2-叔丁基二甲基硅烷氧基乙基)哌嗪-1-基苯胺代替4，并将用含TFA的DCM脱除TBS醚的保护基作为步骤5，来制备标题化合物。1H-NMR(DMSO-D6,500MHz):δ8.19(s,1H),7.75-7.70(m,2H),7.42-7.35(m,2H),7.12-7.05(m,2H),6.97(dd,J＝2.0,10.5Hz,1H),6.93(s,1H),6.72(d,J＝6.5Hz,1H),6.57-6.54(m,1H),6.44(d,J＝17.0Hz,1H),6.29-6.20(m,1H),5.78(d,J＝10.0Hz,1H),3.68(t,J＝5.5Hz,2H),3.00-2.94(m,4H),2.63-2.56(m,6H)。MS:m/e＝479(M++1)。
实例129
制备N-(3-(5-氟-2-(3-((1-甲基哌啶-3-基)甲氧基)苯基氨基)嘧啶-4-基氧基)苯基)丙烯酰胺I-81
根据实例98中所述的步骤、方案和中间物，在步骤2中使用3-(1-甲基哌啶-3-基)甲氧基苯胺代替4，来制备标题化合物。1H-NMR(CDCl3,500MHz):δ8.19(d,J＝2.5Hz,1H),7.82-7.75(m,2H),7.42-7.36(m,2H),7.08-7.02(m,3H),6.99(d,J＝7.0Hz,1H),6.91(s,1H),6.79(d,J＝7.5Hz,1H),6.48-6.44(m,1H),6.42(s,1H),6.29-6.23(m,1H),5.77(d,J＝10Hz,1H),3.67-3.62(m,2H),2.95-2.91(m,1H),2.82-2.76(m,1H),2.28(s,3H),2.11-2.05(m,1H),1.98-1.92(m,1H),1.79-1.70(m,3H),1.11-1.04(m,1H)。MS:m/e＝478(M++1)。
实例130
制备N-(3-(5-氟-2-(3-((1-甲基哌啶-4-基)甲氧基)苯基氨基)嘧啶-4-基氧基)苯基)-丙烯酰胺I-75
根据实例98中所述的步骤、方案和中间物，在步骤2中使用3-(1-甲基哌啶-4-基)甲氧基苯胺代替4，来制备标题化合物。1H-NMR(DMSO-D6,500MHz):δ10.31(s,1H),9.50(s,1H),8.50(s,1H),7.67(s,1H),7.55(d,J＝8.0Hz,1H),7.42(t,J＝8.0Hz,1H),7.10(s,1H),7.04(d,J＝7.0Hz,2H),6.94(t,J＝8.0Hz,1H),6.45-6.39(m,2H),6.27(d,J＝15.0Hz,1H),5.78(dd,J＝2.0,10.5Hz,1H),3.64(d,J＝6.0Hz,2H),2.75(d,J＝6.5Hz,2H),2.14(s,3H),1.83(t,J＝10.5Hz,2H),1.66-1.64(m,3H),1.25-1.23(m,2H)。MS:m/e＝478(M++1)。
实例131
制备N-(3-(5-氰基-2-(苯基氨基)嘧啶-4-基氨基)苯基)丙烯酰胺I-157
根据实例94中所述的方案、步骤和中间物，在步骤2中使用2,4-二氯-5-氰基嘧啶代替4，来制备标题化合物。MS 379.1(M+Na)。
实例132
制备N-(3-(5-氟-2-(3-(三氟甲氧基)苯基氨基)嘧啶-4-基氨基)苯基)丙烯酰胺I-244
根据实例20中所述的方案、步骤和中间物，在步骤2中使用3-(三氟甲氧基)苯胺代替4，来制备标题化合物。MS 434.1(M+1)。
实例133
制备N-(3-(5-氟-2-(吡啶-3-基氨基)嘧啶-4-基氨基)苯基)丙烯酰胺I-234
根据实例20中所述的方案、步骤和中间物，在步骤2中使用3-氨基吡啶代替4，来制备标题化合物。MS 351.1(M+1)。
实例134
制备N-(3-(5-氟-2-(4-氟苯基氨基)嘧啶-4-基氨基)苯基)丙烯酰胺I-247
根据实例20中所述的方案、步骤和中间物，在步骤2中使用4-氟苯胺代替4，来制备标题化合物。MS 368.1(M+1)
实例135
制备N-(3-(5-氟-2-(3-(3-(N-吗啉基)丙氧基)苯基氨基)嘧啶-4-基氨基)苯基)丙烯酰胺I-208
根据实例20中所述的方案、步骤和中间物，在步骤2中使用3-(3-(N-吗啉基)丙氧基)苯胺代替4，来制备标题化合物。MS 515.3(M+Na)。
实例136
制备N-(3-(2-(3-(3-(1H-咪唑-1-基)丙氧基)苯基氨基)-5-氟嘧啶-4-基氨基)苯基)丙烯酰胺I-204
根据实例20中所述的方案、步骤和中间物，在步骤2中使用3-(3-(1H-咪唑-1-基)丙氧基)苯胺代替4，来制备标题化合物。MS 474.3(M+Na)。
实例137
制备N-(3-(2-(1-乙酰基哌啶-3-基氨基)-5-氟嘧啶-4-基氨基)苯基)丙烯酰胺I-238
根据实例20中所述的方案、步骤和中间物，在步骤2中使用1-(3-氨基哌啶-1-基)乙酮代替4，来制备标题化合物。MS 421.1(M+Na)。
实例138
制备N-(3-(5-氟-2-(苯基氨基)嘧啶-4-基氧基)苯基)丙烯酰胺I-228
根据实例98中所述的方案、步骤和中间物，在步骤2中使用苯胺代替4，来制备标题化合物。MS 351.3(M+1)。
实例139
制备N-(3-(5-氟-2-(6-甲氧基吡啶-3-基氨基)嘧啶-4-基氨基)苯基)丙烯酰胺I-243
根据实例20中所述的方案、步骤和中间物，在步骤2中使用6-甲氧基吡啶-3-胺代替4，来制备标题化合物。MS 381.1(M+1)。
实例140
制备N-(3-(5-甲氧基-2-(3-甲氧基苯基氨基)嘧啶-4-基氨基)苯基)丙烯酰胺I-158
根据实例1中所述的方案、步骤和中间物，在步骤1中使用5-甲氧基-2,4-二氯嘧啶代替1，并在步骤2中使用3-甲氧基苯胺代替4，来制备标题化合物。MS 392.3(M+1)。
实例141
制备N-(3-(5-甲氧基-2-(6-甲氧基吡啶-3-基氨基)嘧啶-4-基氨基)苯基)丙烯酰胺I-192
根据实例1中所述的方案、步骤和中间物，在步骤1中使用5-甲氧基-2,4-二氯嘧啶代替1，并在步骤2中使用5-氨基-2-甲氧基吡啶代替4，来制备标题化合物。MS 393.3(M+1)。
实例142
制备N-(3-(5-氟-2-(6-甲氧基吡啶-3-基氨基)嘧啶-4-基氧基)苯基)丙烯酰胺I-222
根据实例98中所述的方案、步骤和中间物，在步骤2中使用3-氨基-6-甲氧基吡啶代替4，来制备标题化合物。MS 382.3(M+1)。
实例143
制备4-(3-丙烯酰胺基苯基氨基)-N-叔丁基-2-(6-甲氧基吡啶-3-基氨基)嘧啶-5-甲酰胺I-216
根据实例37中所述的方案、步骤和中间物，在步骤1中使用叔丁胺代替2并省略步骤6，来制备标题化合物。MS 484.3(M+Na)。
实例144
制备(R)-1-(3-(5-氟-2-(6-甲氧基吡啶-3-基氨基)嘧啶-4-基氨基)哌啶-1-基)丙-2-烯-1-酮I-202
根据实例20中所述的方案、步骤和中间物，在步骤1中使用(R)-3-氨基哌啶-1-甲酸叔丁酯代替2，并在步骤2中使用3-氨基-6-甲氧基吡啶代替4，来制备标题化合物。MS395.3(M+Na)。
实例145
制备(R)-1-(3-(5-氟-2-(3-甲氧基苯基氨基)嘧啶-4-基氨基)哌啶-1-基)丙-2-烯-1-酮I-195
根据实例20中所述的方案、步骤和中间物，在步骤1中使用(R)-3-氨基哌啶-1-甲酸叔丁酯代替2，并在步骤2中使用3-甲氧基苯胺代替4，来制备标题化合物。MS 394.3(M+Na)。
实例146
制备(S)-1-(3-(5-氟-2-(6-甲氧基吡啶-3-基氨基)嘧啶-4-基氨基)哌啶-1-基)丙-2-烯-1-酮I-197
根据实例20中所述的方案、步骤和中间物，在步骤1中使用(S)-3-氨基哌啶-1-甲酸叔丁酯代替2，并在步骤2中使用3-氨基-6-甲氧基吡啶代替4，来制备标题化合物。MS373.3(M+1)。
实例147
制备(S)-1-(3-(5-氟-2-(3-甲氧基苯基氨基)嘧啶-4-基氨基)哌啶-1-基)丙-2-烯-1-酮I-196
根据实例20中所述的方案、步骤和中间物，在步骤1中使用(S)-3-氨基哌啶-1-甲酸叔丁酯代替2，并在步骤2中使用3-甲氧基苯胺代替4，来制备标题化合物。MS 372.3(M+1)。
实例148
制备(R)-1-(3-(5-氟-2-(6-甲氧基吡啶-3-基氨基)嘧啶-4-基氧基)哌啶-1-基)丙-2-烯-1-酮I-180
根据实例98中所述的方案、步骤和中间物，在步骤1中使用(R)-3-羟基哌啶-1-甲酸叔丁酯代替2，并在步骤2中使用3-氨基-6-甲氧基吡啶代替4，来制备标题化合物。MS374.3(M+1)。
实例149
制备(R)-1-(3-(5-氟-2-(3-甲氧基苯基氨基)嘧啶-4-基氧基)哌啶-1-基)丙-2-烯-1-酮I-190
根据实例98中所述的方案、步骤和中间物，在步骤1中使用(R)-3-羟基哌啶-1-甲酸叔丁酯代替2，并在步骤2中使用3-甲氧基苯胺代替4，来制备标题化合物。MS 395.3(M+Na)。
实例150
制备(S)-1-(3-(5-氟-2-(6-甲氧基吡啶-3-基氨基)嘧啶-4-基氧基)哌啶-1-基)丙-2-烯-1-酮I-193
根据实例98中所述的方案、步骤和中间物，在步骤1中使用(S)-3-羟基哌啶-1-甲酸叔丁酯代替2，并在步骤2中使用3-氨基-6-甲氧基吡啶代替4，来制备标题化合物。MS396.3(M+Na)。
实例151
制备(S)-1-(3-(5-氟-2-(3-甲氧基苯基氨基)嘧啶-4-基氧基)哌啶-1-基)丙-2-烯-1-酮I-179
根据实例98中所述的方案、步骤和中间物，在步骤1中使用(S)-3-羟基哌啶-1-甲酸叔丁酯代替2，并在步骤2中使用3-甲氧基苯胺代替4，来制备标题化合物。MS 395.3(M+Na)。
实例152
制备1-(3-(5-氟-2-(6-甲氧基吡啶-3-基氨基)嘧啶-4-基氨基)吡咯烷-1-基)丙-2-烯-1-酮I-203
根据实例20中所述的方案、步骤和中间物，在步骤1中使用3-氨基吡咯烷-1-甲酸叔丁酯代替2，并在步骤2中使用3-氨基-6-甲氧基吡啶代替4，来制备标题化合物。MS381.3(M+Na)。
实例153
制备1-(3-(5-氟-2-(3-甲氧基苯基氨基)嘧啶-4-基氨基)吡咯烷-1-基)丙-2-烯-1-酮I-201
根据实例20中所述的方案、步骤和中间物，在步骤1中使用3-氨基吡咯烷-1-甲酸叔丁酯代替2，并在步骤2中使用3-甲氧基苯胺代替4，来制备标题化合物。MS 358.3(M+1)。
实例154
制备(R)-1-(3-(5-氟-2-(3-甲氧基苯基氨基)嘧啶-4-基硫基)哌啶-1-基)丙-2-烯-1-酮I-137
根据实例20中所述的方案、步骤和中间物，在步骤1中使用(S)-3-巯基哌啶-1-甲酸叔丁酯代替2，并在步骤2中使用3-甲氧基苯胺代替4，来制备标题化合物。MS 411.1(M+Na)。
实例155
制备(R)-1-(3-(2-(3-氯苯基氨基)-5-氟嘧啶-4-基氨基)哌啶-1-基)丙-2-烯-1-酮I-147
根据实例20中所述的方案、步骤和中间物，在步骤1中使用(S)-3-氨基哌啶-1-甲酸叔丁酯代替2，并在步骤2中使用3-氯苯胺代替4，来制备标题化合物。MS 376.1(M+1)。
实例156
制备(R)-1-(3-(5-氟-2-(3-(2-(N-吗啉基)乙氧基)苯基氨基)嘧啶-4-基氨基)哌啶-1-基)丙-2-烯-1-酮I-135
根据实例20中所述的方案、步骤和中间物，在步骤1中使用(S)-3-氨基哌啶-1-甲酸叔丁酯代替2，并在步骤2中使用3-(2-(N-吗啉基)乙氧基)苯胺代替4，来制备标题化合物。MS 471.3(M+1)。
实例157
制备(E)-4-(二甲基氨基)-N-(3-(5-氟-2-(6-甲氧基吡啶-3-基氨基)嘧啶-4-基氨基)苯基)丁-2-烯酰胺I-125
根据实例139中所述的方案、步骤和中间物，在步骤4中使用(E)-4-(二甲基氨基)丁-2-烯酰氯代替7，来制备标题化合物。MS 460.1(M+Na)。
实例158
制备2-((1H-吡唑-1-基)甲基)-N-(3-(5-氟-4-(间甲苯基氨基)嘧啶-2-基氨基)苯基)丙烯酰胺I-98
根据实例4中所述的方案、步骤和中间物，在步骤3中使用2-((1H-吡唑-1-基)甲基)丙烯酰氯代替6，来制备标题化合物。MS 466.1(M+Na)。
实例159
制备(E)-4-(氮杂环丁-1-基)-N-(3-(5-氟-4-(间甲苯基氨基)嘧啶-2-基氨基)苯基)丁-2-烯酰胺I-123
根据实例4中所述的方案、步骤和中间物，在步骤3中使用(E)-4-(氮杂环丁-1-基)丁-2-烯酰氯代替6，来制备标题化合物。MS 455.1(M+Na)。
实例160
制备(E)-N-(3-(5-氟-4-(间甲苯基氨基)嘧啶-2-基氨基)苯基)-4-(N-吗啉基)丁-2-烯酰胺I-102
根据实例4中所述的方案、步骤和中间物，在步骤3中使用(E)-4-(吗啉-4-基)丁-2-烯酰氯代替6，来制备标题化合物。MS 485.3(M+Na)。
实例161
制备(E)-4-((1S,4S)-2,5-二氮杂双环[2.2.1]庚-2-基)-N-(3-(5-氟-4-(间甲苯基氨基)嘧啶-2-基氨基)苯基)丁-2-烯酰胺I-101
根据实例4中所述的方案、步骤和中间物，在步骤3中使用(E)-4-((1S,4S)-2,5-二氮杂双环[2.2.1]庚-2-基)丁-2-烯酰氯代替6，来制备标题化合物。MS 496.1(M+Na)。
实例162
制备(E)-N-(3-(5-氟-4-(间甲苯基氨基)嘧啶-2-基氨基)苯基)-4-((2-甲氧基乙基)(甲基)氨基)丁-2-烯酰胺I-120
根据实例4中所述的方案、步骤和中间物，在步骤3中使用(E)-4-((2-甲氧基乙基)(甲基)氨基)丁-2-烯酰氯代替6，来制备标题化合物。MS 487.3(M+Na)。
实例163
制备(S,E)-N-(3-(5-氟-4-(间甲苯基氨基)嘧啶-2-基氨基)苯基)-4-(3-羟基吡咯烷-1-基)丁-2-烯酰胺I-99
根据实例4中所述的方案、步骤和中间物，在步骤3中使用(S,E)-4-(3-羟基吡咯烷-1-基)丁-2-烯酰氯代替6，来制备标题化合物。MS 485.3(M+Na)
实例164
制备(R,E)-N-(3-(5-氟-4-(间甲苯基氨基)嘧啶-2-基氨基)苯基)-4-(3-羟基吡咯烷-1-基)丁-2-烯酰胺I-104
根据实例4中所述的方案、步骤和中间物，在步骤3中使用(R,E)-4-(3-羟基吡咯烷-1-基)丁-2-烯酰代替6，来制备标题化合物。MS 485.3(M+Na)。
实例165
制备(E)-N-(3-(5-氟-4-(间甲苯基氨基)嘧啶-2-基氨基)苯基)-4-(1H-吡唑-1-基)丁-2-烯酰胺I-100
根据实例4中所述的方案、步骤和中间物，在步骤3中使用(E)-4-(1H-咪唑-1-基)丁-2-烯酰氯代替6，来制备标题化合物。MS 466.1(M+Na)。
实例166
制备(R,E)-N-(3-(5-氟-2-(4-(2-甲氧基乙氧基)苯基氨基)嘧啶-4-基氨基)苯基)-4-(3-羟基吡咯烷-1-基)丁-2-烯酰胺I-89
根据实例20中所述的方案、步骤和中间物，在步骤4中使用(R,E)-4-(3-羟基吡咯烷-1-基)丁-2-烯酰氯代替7，来制备标题化合物。MS 545.3(M+Na)。
实例167
制备(S,E)-N-(3-(5-氟-2-(4-(2-甲氧基乙氧基)苯基氨基)嘧啶-4-基氨基)苯基)-4-(3-羟基吡咯烷-1-基)丁-2-烯酰胺I-88
根据实例20中所述的方案、步骤和中间物，在步骤4中使用(S,E)-4-(3-羟基吡咯烷-1-基)丁-2-烯酰氯代替7，来制备标题化合物。MS 545.3(M+Na)。
实例168
制备2-((1H-吡唑-1-基)甲基)-N-(3-(5-氟-2-(4-(2-甲氧基乙氧基)苯基氨基)嘧啶-4-基氨基)苯基)丙烯酰胺I-85
根据实例20中所述的方案、步骤和中间物，在步骤4中使用2-((1H-吡唑-1-基)甲基)丙烯酰氯代替7，来制备标题化合物。MS 526.1(M+Na)。
实例169
制备N-(3-(5-氟-2-(苯基氨基)嘧啶-4-基氨基)苯基)丙烯酰胺I-28
根据实例20中所述的方案、步骤和中间物，在步骤2中使用苯胺代替4，来制备标题化合物。MS 372.1(M+Na)。
实例170
制备(E)-4-((3R,5S)-3,5-二甲基哌嗪-1-基)-N-(3-(5-氟-4-(间甲苯基氨基)嘧啶-2-基氨基)苯基)丁-2-烯酰胺I-119
根据实例4中所述的方案、步骤和中间物，在步骤3中使用(E)-4-((3R,5S)-3,5-二甲基哌嗪-1-基)丁-2-烯酰氯代替6，来制备标题化合物。MS 512.3(M+Na)。
实例171
制备1-(3-(5-甲基-2-(3-氨基磺酰基苯基氨基)嘧啶-4-基氨基)苯基)-3-甲基丁-2-烯-1-酮I-224
根据实例112中所述的方案、步骤和中间物，在步骤1中使用2,4-二氯-5-甲基嘧啶代替1，并在步骤2中使用3-氨基苯磺酰胺代替4，来制备标题化合物。1H NMR(DMSO-d6)δppm:1.97(s,3H),2.14(s,6H),6.88(s,1H),7.25-7.30(m,4H),7.47(t,J＝7.92Hz,1H),7.62(d,J＝7.72Hz.1H),7.96(s,1H),8.0-8.07(m,3H),8.20(t,J＝7.36Hz,1H),8.55(s,1H),9.37(s,1H)；LCMS:m/e 438(M+1)。
实例172
制备N-(3-丙烯酰胺基苯基)-N-(5-氰基-2-(6-甲氧基吡啶-3-基氨基)嘧啶-4-基)丙烯酰胺I-171
根据实例95中所述的方案、步骤和中间物，在步骤4中使用过量的丙烯酰氯，来制备标题化合物。MS m/z:442.1(M+H+)。
实例173
制备N-3-(N-甲基-N-(5-氟-2-(4-甲基-3,4-二氢-2H-苯并[b][1,4]噁嗪-6-基氨基)嘧啶-4-基)氨基苯基丙烯酰胺I-127
通过在乙腈和乙酸(4:1)中用过量的甲醛和NaBH3CN(2当量)处理实例88的产物，来制备标题化合物。MS m/z:435.1(M+H+)。
实例174
制备N-(3-(5-甲基-2-(苯基氨基)嘧啶-4-基氨基)苯甲基)丙烯酰胺I-205
根据实例20中所述的方案、步骤和中间物，在步骤1中使用2,4-二氯-5-甲基嘧啶代替1并使用3-(叔丁氧羰基氨基)甲基苯胺代替2，且在步骤2中使用苯胺代替4，来制备标题化合物。1H-NMR(CDCl3,500MHz):δ7.91(s,1H),7.77(s,1H),7.57(d,J＝9.0Hz,2H),7.41(d,J＝8.0Hz,1H),7.36-7.26(m,2H),7.13-6.96(m,4H),6.36-6.25(m,2H),5.97(dd,J＝10.5,17.0Hz,1H),5.78(bs,1H),5.63(d,J＝10.5Hz,1H),4.51(d,J＝6.0Hz,2H),2.12(s,3H)。MS:m/e＝360(M++1)。
实例175
制备(E)-丁-2-烯酸3-(5-甲基-2-(苯基氨基)嘧啶-4-基氨基)苯甲酯I-246
根据下文所述的方案、步骤和中间物制备标题化合物。
A)2，Xanthophos，Pd2(dba)3，Cs2CO3，CH3CN，90℃，12小时；B)4，t-BuOH，90℃，4小时；C)6，TEA，DCM，-30℃，5分钟
步骤1
在室温下，于氮气氛围下向经搅拌的1(0.34g，2.08mmol)于乙腈(5mL)中的溶液中添加Cs2CO3(1.09g，3.35mmol)、Xanthophos(0.024g，0.041mmol)、Pd2(dba)3(38mg，0.04mmol)和2(0.5g，2.1mmol)。用氩气净化反应混合物1小时，并在90℃下搅拌12小时。借助TLC监测反应的进展。反应混合物经celite垫过滤并在减压下浓缩滤液。借助硅胶管柱色谱法纯化粗化合物，得到浅黄色液体状的3(0.56g，29.16％)。1H-NMR(CDCl3,500MHz):δ8.0(s,1H),7.55(s,1H),7.51(d,J＝8.0Hz,1H),(t,J＝7.5Hz,1H),(d,J＝7.5Hz,1H),6.48(s,1H),4.76(s,2H),2.18(s,3H),0.95(s,9H),0.10(s,6H)。MS:m/e＝364[M++1]。
步骤2
在室温下，向经搅拌的3(0.07g，0.19mmol)于t-BuOH(1.5mL)中的溶液中添加苯胺(4)(0.018g，0.19mmol)。将反应混合物加热到90℃，并在相同温度下搅拌4小时。借助TLC监测反应的进展。原料消耗完全后，在减压下去除挥发性物质，得到浅黄色固体状的5(0.033g，55.9％)。1H-NMR(DMSO-d6,500MHz):δ10.45(s,1H),9.82(s,1H),7.91(s,1H),7.58-7.01(m,9H),4.50(s,2H),2.16(s,3H)。MS:m/e＝307[M++1]。
步骤3
在-30℃下，于氮气氛围下向经搅拌的5(0.5g，1.63mmol)于DCM(5mL)中的溶液中依次添加6(0.18g，1.72mmol)和TEA(0.66mL，4.78mmol)。在-30℃下搅拌反应混合物5分钟，并借助TLC监测反应的进展。反应完成后，用水淬灭，并用DCM萃取2次，每次50mL。分离有机层，用无水Na2SO4干燥，并在减压下浓缩。借助硅胶管柱色谱法纯化粗物质，得到50mg标题化合物的异构体混合物。在室温下，用DBU(0.02g，0.127mmol)处理于DCM(2mL)中的此混合物。在室温下搅拌反应混合物2小时，用水淬灭，并用DCM萃取2次，每次10mL。分离有机层，用无水Na2SO4干燥，并在减压下浓缩，得到浅黄色固体状I-246(0.05g，10％)。1H-NMR(CDCl3,500MHz):δ7.87(s,1H),7.65(s,1H),7.58-7.51(m,3H),7.34(t,J＝7.5Hz,1H),7.30-7.23(m,3H),7.13(d,J＝7.5Hz,1H),7.08-6.96(m,2H),6.40(s,1H),5.87(dd,J＝1.5,15.5Hz,1H),5.16(s,2H),2.13(s,3H),1.87(dd,J＝2.0,7.0Hz,3H)。13C-NMR(CDCl3,125MHz):δ166.3,159.1,158.4,155.4,145.3,139.9,138.9,137.0,128.9,128.7,123.2,122.4,121.9,121.2,121.0,119.3,105.2,65.7,17.9,13.2。MS:m/e＝375[M++1]。
实例176
制备(E)-丁-2-烯酸4-(5-甲基-2-(苯基氨基)嘧啶-4-基氨基)苯甲酯I-60
根据实例175中所述的方案、步骤和中间物，在步骤1中使用4-((叔丁基二甲基硅烷氧基)甲基)苯胺代替2，来制备标题化合物。1H-NMR(CDCl3,500MHz):δ8.19(bs,1H),7.81(s,1H),7.56(d,J＝8.5Hz,2H),7.53(d,J＝7.5Hz,2H),7.42-7.36(m,3H),7.28-7.22(m,1H),7.08-6.98(m,2H),6.54(s,1H),5.89(dd,J＝12.5,14.0Hz,1H),5.17(s,2H),2.15(s,3H),1.89(dd,J＝1.5,7.0Hz,3H)。MS:m/e＝375[M++1]。
实例177
制备N-甲基-N-(3-(5-甲基-2-(苯基氨基)嘧啶-4-基氨基)苯甲基)丙烯酰胺I-220
根据下文所述的方案、步骤和中间物制备标题化合物。
A)2，Xanthophos，Pd2(dba)3，Cs2CO3，CH3CN，100℃，12小时；B)4，t-BuOH，90℃，4小时；C)10N HCl，DCM，室温，30分钟：D)7，TEA，DCM，-10℃，10分钟。
步骤1
向经搅拌的1(2.6g，15.7mmol)于乙腈(26.7mL)中的溶液中添加2(2.67g，11.3mmol)、Pd2(dba)3(0.31g，0.33mmol)、Xanthophos(0.52g，0.89mmol)和Cs2CO3(6.6g，20.0mmol)。随后通过用氩气净化1小时来使反应混合物脱气，并进一步加热到100℃，持续12小时。反应完成(借助TLC监测)后，反应混合物经celite垫过滤，并在减压下浓缩滤液。借助管柱色谱法(60-120目硅胶；20％乙酸乙酯/己烷)纯化得到的粗物质，得到浅褐色固体状的3(2.32g，56.71％)。1H-NMR(CDCl3,500MHz):δ8.01(s,1H),7.56(d,J＝7.5Hz,1H),7.43(s,1H),7.35(t,J＝7.0Hz,1H),7.05(s,1H),6.80(bs,1H),4.45(s,2H),2.87(s,3H),2.30(s,3H),1.48(s,9H)。
步骤2
在室温下，向经搅拌的3(2.32g，6.0mmol)于t-BuOH(11.6mL)中的溶液中添加4(0.65g，6.9mmol)，并在回流下进一步加热反应混合物48小时。借助TLC监测反应的进展。反应完成后，在减压下浓缩t-BuOH至干，得到浅黄色固体状的5(2.3g，85.82％)。1H-NMR(DMSO-d6,500MHz):δ10.32(s,1H),9.78(s,1H),7.91(s,1H),7.50(d,J＝8.0Hz,1H),7.45-7.30(m,4H),7.24(t,J＝7.0Hz,2H),7.15-7.06(m,2H),4.36(s,2H),2.72(s,3H),2.17(s,3H),1.41,1.34(两个单峰,9H)。MS:m/e＝420(M++1)。
步骤3
向经搅拌的5(0.05mg，0.11mmol)于DCM(5mL)中的溶液中添加37％HCl(1.0mL)，并在室温下搅拌30分钟。反应完成(借助TLC监测)后，在减压下去除挥发性物质。将水层冷却到0℃，用10％NaOH溶液碱化到pH值为约8-9，并用DCM(50mL)萃取。分离有机部分，用水、盐水洗涤，用无水Na2SO4干燥，并在减压下蒸发，得到浅黄色固体状的6(0.015g，48.36％)。1H-NMR(CDCl3,500MHz):δ7.95-7.85(m,2H),7.68-7.60(m,3H),7.42(d,J＝8.0Hz,1H),7.32-7.20(m,4H),7.05(d,J＝7.5Hz,1H),7.00-6.95(m,1H),6.40(s,1H),3.84(s,2H),2.48(s,3H),2.06(s,3H)。MS:m/e＝320(M++1)。
步骤4
在-10℃下，于惰性氛围下经5分钟向经搅拌的6(0.3g，0.94mmol)于DCM(12mL)中的溶液中逐滴添加TEA(0.10g，0.99mmol)和7(0.08g，0.88mmol)。随后在-10℃下搅拌反应混合物5到10分钟。反应完成(借助TLC监测)后，用冷水(5mL)淬灭反应混合物，并用DCM萃取2次，每次50mL。用水、盐水洗涤DCM层，用无水Na2SO4干燥，并在减压下浓缩。借助管柱色谱法(60-120目硅胶；30％乙酸乙酯/己烷)纯化粗物质，得到灰白色固体状的I-220(0.15g，42.85％)。1H-NMR(DMSO-d6,500MHz,80℃):δ8.48(bs,1H),8.07(s,1H),7.88(s,1H),7.69-7.58(m,4H),7.28(t,J＝8.0Hz,1H),7.16(t,J＝8.0Hz,2H),6.91-6.85(m,2H),6.75(dd,J＝2.5,15.3Hz,1H),6.13(d,J＝15.0Hz,1H),5.66(d,J＝7.5Hz,1H),4.60(s,2H),2.95(s,3H),2.12(s,3H)。MS:m/e＝374(M++1)。
实例178
制备N-甲基-N-(4-(5-甲基-2-(苯基氨基)嘧啶-4-基氨基)苯甲基)丙烯酰胺I-219
根据实例177中所述的方案、步骤和中间物，在步骤1中使用4-氨基苯甲基(甲基)-氨基甲酸叔丁酯代替2，来制备标题化合物。1H NMR(DMSO-d6,500MHz,80℃):δ8.55(s,1H),8.03(s,1H),7.86(s,1H),7.65(d,J＝8.0Hz,2H),7.62(d,J＝8.0Hz,2H),7.20-7.13(m,4H),6.86-6.75(m,2H),6.14(dd,J＝2.5,17.0Hz,1H),5.67(d,J＝15.0Hz,1H),4.58(s,2H),2.96(s,3H),2.10(s,3H)。MS:m/e＝374(M++1)。
实例179
制备N-(5-(5-乙酰基-4-(4-丙烯酰基-3,4-二氢-2H-苯并[b][1,4]噁嗪-6-基氨基)嘧啶-2-基氨基)吡啶-2-基)-2,2,2-三氟-N-甲基乙酰胺I-142
根据实例42中所述的方案、步骤和中间物，在步骤5中使用5-氨基-2(2,2,2-三氟乙酰胺基)吡啶代替9，来制备标题化合物。LC-MS:m/z 542.2(ES+),540.2.2(ES-)。
实例180
制备1-(6-(5-氟-2-(4-(2-甲氧基乙氧基)苯基氨基)嘧啶-4-基氨基)吲哚啉-1-基)丙-2-烯-1-酮I-94
根据实例20中所述的方案、步骤和中间物，在步骤1中使用N-Boc-6-氨基吲哚啉代替2，来制备标题化合物。LC-MS:m/z 450.1(ES+),448.1(ES-)。
实例181
制备N-(3-(5-氟-2-(6-(2-甲氧基乙氧基)吡啶-3-基氨基)嘧啶-4-基氨基)苯基)丙烯酰胺I-103
根据实例20中所述的方案、步骤和中间物，在步骤2中使用3-氨基-6-(2-甲氧基乙氧基)吡啶代替4，来制备标题化合物。1H NMR(CDCl3+微量DMSO-d6)δppm:3.44(s,3H),3.75(t,J＝4.4Hz,2H),4.43(t,J＝4.4Hz,2H),5.81(dd,J＝1.8&9.6Hz,1H),6.45(m,1H),6.80(m,3H),7.17(m,1H),7.29(m,1H),7.43(m,1H),7.49(m,1H),7.60(m,1H),7.80(dd,J＝2.8&9.2Hz,1H),7.94(d,J＝3.1Hz,1H),8.14(s,1H),8.32(d,J＝2.9Hz,1H)；LCMS:m/e 425.1(M+1)。
实例182
制备N-(3-(5-氟-2-(4-(3-甲磺酰基丙氧基)苯基)氨基嘧啶-4-基氨基)苯基)丙烯酰胺I-97
根据实例20中所述的方案、步骤和中间物，在步骤2中使用4-(3-甲磺酰基丙氧基)苯胺代替4，制备得到呈三氟乙酸盐形式的标题化合物。1H NMR(CDCl3+微量DMSO-d6)δppm:1.95(m,2H),2.67(s,3H),2.98(m,5H),3.74(t,J＝6.0Hz,2H),5.45(dd,J＝4.1&7.3Hz,1H),6.07(m,2H),6.48(d,J＝8.2Hz,1H),6.77(m,4H),7.09(d,J＝7.4Hz,1H),7.51(d,J＝4.1Hz,1H),7.70(br,1H)；LCMS:m/e 486.1(M+1)。
实例183
制备N-(3-(5-氟-2-(6-(三氘代甲氧基)吡啶-3-基氨基)嘧啶-4-基氨基)苯基)丙烯酰胺I-95
根据实例20中所述的方案、步骤和中间物，在步骤2中使用6-(三氘代甲氧基)吡啶-3-胺代替4，制备得到呈三氟乙酸盐形式的标题化合物。1H NMR(CDCl3+微量DMSO-d6)δppm:5.78(dd,J＝3.7&7.8Hz,1H),6.40(m,2H),6.71(d,J＝8.7Hz,1H),7.3(m,3H),7.75(dd,J＝2.7&8.7Hz,1H),7.82(d,J＝4.6Hz,1H),7.95(s,1H),8.33(d,J＝2.3Hz,1H)；LCMS:m/e 384.1(M+1)。
根据下文所示的方案制备中间物6-(三氘化甲氧基)吡啶-3-胺。
A)NaH，CD3OD，室温，；BH3·NMe3，Pd(OH)2
步骤1
在0℃下，向含NaH(60％，0.30g)的5mL CD3OD中添加2-氯-5-硝基吡啶(1.0g)。在室温下，搅拌混合物过夜。向此混合物中添加BH3·NMe3(550mg)和Pd(OH)2(100mg)。使反应混合物回流2小时。冷却后，浓缩混合物，并使用硅胶色谱法纯化，得到所需的6-(三氘化甲氧基)吡啶-3-胺(130mg)。1H NMR(CDCl3)δppm:3.30(br,2H),6.60(d,J＝8.7Hz,1H),7.03(dd,J＝3.2&8.7Hz,1H),7.66(d,J＝3.2Hz,1H)。
实例184
制备N-(3-(5-氟-2(3,4,5-三甲氧基苯基氨基)嘧啶-4-基氧基)苯基)丙烯酰胺I-148
根据实例98中所述的方案、步骤和中间物，在步骤2中使用3,4,5-三甲氧基苯胺代替4，来制备标题化合物。MS:m/e 441[M+1]。
实例185
制备3-甲基-1-(3-(5-甲基-2-(苯基氨基)嘧啶-4-基氨基)苯基)丁-2-烯-1-酮I-232
根据实例112中所述的方案、步骤和中间物，在步骤1中使用2,4-二氯-5-甲基嘧啶代替1，并在步骤2中使用苯胺代替4，来制备标题化合物。1H NMR(CDCl3)δppm:1.97(s,3H),2.15(s,3H),2.22(s,3H),6.47(s,1H),6.71(s,1H),6.97(t,J＝9.8Hz,1H),7.17(s,1H),7.24(t,J＝10.36Hz,1H),7.27(s,1H),7.44(t,J＝10.64Hz,1H),7.53(d,J＝10.48Hz,2H),7.68(d,J＝10.28Hz,1H),7.94(d,J＝10Hz,1H),7.98(s,1H)；LCMS:m/e 359(M+1)。
实例186
制备1-(3-(5-甲基-2-苯基氨基)嘧啶-4-基氨基(哌啶-1-基)丙-2-烯-酮I-27
根据实例1中所述的方案、步骤和中间物，在步骤1中使用1-叔丁氧羰基-3-氨基哌啶代替1，来制备标题化合物。1H NMR(DMSO-d6)δppm:1.30-1.50(m,1H),1.55-1.75(m,1H),1.75-1.90(m,1H),1.92(s,3H),1.95-2.05(m,1H),2.75-3.31(m,2H),3.99-4.09(m,2H),4.10-4.15&4.40-4.47(m,1H),5.49&5.70(分别为d,J＝10.8Hz&d,J＝9.2Hz,总共1H),6.02&6.13(分别为d,J＝17.6Hz&d,J＝16.8Hz,总共1H),6.25-6.40(m,1H),6.63&6.80-6.90(分别为dd,J＝10.8,16.8Hz&m,总共1H),6.75-6.85(m,1H),7.15(t,J＝8Hz,2H),7.69(bs,3H),8.81(s,1H)；LCMS:m/e 337.8(M+1)。
实例187
制备3-(4-(2-丙烯酰基-1,2,3,4-四氢异喹啉-6-基氨基)-5-甲基嘧啶-2-基氨基)苯磺酰胺I-40
根据实例1中所述的方案、步骤和中间物，在步骤1中使用6-氨基-2-叔丁氧羰基-1,2,3,4-四氢异喹啉代替1，来制备标题化合物。1H NMR(DMSO-d6)δppm:2.10(s,3H),2.80-2.83(m,2H),3.75-3.90(m,2H),4.66(s,1H),4.76(s,1H),5.71-5.74(m,1H),6.16(dd,J＝2.32&16.76Hz,1H),6.87-6.91(m,1H),7.13-7.18(m,1H),7.25-7.31(m,4H),7.53-7.57(m,2H),7.90(s,1H),8.05(s,2H),8.28(s,1H),9.31(s,1H)；LCMS:m/e 464.8(M+1)。
实例188
制备(S)-N-(3-(5-氟-2-(四氢呋喃-3-基氧基)吡啶-3-基氨基)嘧啶-4-基氨基)苯基)丙烯酰胺I-54
根据实例20中所述的方案、步骤和中间物，在步骤2中使用(S)-3-氨基-6-(四氢呋喃-3-基氧基)吡啶代替4，来制备标题化合物。MS:m/e＝437[M+1]。
实例189
制备N-(3-(5-三氟甲基-2-(苯基氨基)嘧啶-4-基氨基)苯基)丙烯酰胺I-245
根据下文所述的方案、步骤和中间物制备标题化合物。
A)2，ZnCl2，DCE，t-BuOH(1:1)，0℃，30分钟；B)4，DMF，DIEPA，70℃，16小时；C)TFA，DCM，室温，1小时；D)7，TEA，DCM。
步骤1
向1(2g，9.2mmol)于80mL 1:1的tBuOH/DCE混合物中的冷(0℃)溶液中添加氯化锌(11mL的1M乙醚溶液，1.2当量)。1小时后，添加2(0.858g，9.2mmol)，随后逐滴添加含三乙胺(1.03g；1.1当量)的10mL DCE/t-BuOH。搅拌30分钟后，在减压下去除溶剂，并将残余物溶解于乙酸乙酯(50mL)中，且用盐水(10mL)洗涤。用硫酸钠干燥有机层，过滤并且在真空中浓缩。从EtOAc/己烷(1:9)中再结晶，随后得到白色固体状所需产物3(2g，80％)。
步骤2
向3(0.5g，1.82mmol)和4(0.38g，1.83mmol)于DMF(10mL)中的溶液中添加DIPEA(0.283g，2.192mmol)，并在氩气氛围下，将混合物加热到60℃，保持16小时。蒸馏去除溶剂，并将残余物溶解于乙酸乙酯(50mL)中，且用盐水(10mL)洗涤。用硫酸钠干燥有机层，过滤并在真空中浓缩。借助快速管柱色谱法(洗脱剂：EtOAc/己烷1:1)纯化粗混合物，得到白色固体状的5(0.48g，60％)。
步骤3
向6(0.25g，0.63mmol)于CH2Cl2(10mL)中的溶液中添加三氟乙酸(2mL)，并在室温下搅拌混合物1小时。在减压下去除溶剂，并将残余物溶解于CH2Cl2中，用10％NaHCO3水溶液洗涤，干燥(Na2SO4)，过滤并在减压下蒸发，得到白色固体状的自由胺。
步骤4
在氩气氛围下，向冷却到-40℃的经搅拌的6(0.2g)于DCM(20mL)中的溶液中添加三乙胺，随后逐滴添加7(0.069g，0.686mmol)。在-40℃下搅拌得到的混合物10分钟。用DCM(50mL)稀释反应混合物，并用盐水(10mL)洗涤。用硫酸钠干燥有机层，过滤并在减压下蒸发。借助硅胶快速色谱法，使用(MeOH-EtOAc 5:95)作为洗脱剂来纯化残余物，得到目标化合物I-245。1H NMR(200MHz,CD3OD)δ8.25(s,1H),7.80(s,1H),7.60-7.05(m,7H),6.90(m,1H),6.35(m,2H),5.75(dd,J＝8.0,2.0Hz,1H)。
实例190
制备N-(3-(5-三氟甲基-2-(3-甲氧基苯基氨基)嘧啶-4-基氨基)苯基)丙烯酰胺I-242
根据实例189中所述的方案、步骤和中间物，在步骤1中使用3-甲氧基苯胺代替2，来制备标题化合物。1H NMR(200MHz,CD3OD)δ8.31(s,1H),7.84(s,1H),7.59(m,1H),7.37-7.09(m,5H)6.53(m,1H),6.41(m,2H),5.79(dd,J＝8.0,2.0,Hz,1H),3.66(s,3H)。
实例191
制备N-(4-(5-三氟甲基-2-(3-甲氧基苯基氨基)嘧啶-4-基氨基)苯基)丙烯酰胺I-236
根据实例189中所述的方案、步骤和中间物，在步骤1中使用3-甲氧基苯胺代替2，并在步骤2中使用4-氨基-N-叔丁氧羰基苯胺代替4，来制备标题化合物。1H NMR(200MHz,CD3OD)δ8.27(s,1H),7.70(d,J＝6.0Hz)1H),7.46(d,J＝6.0Hz,1H),7.09(brs,1H),7.07(m,2H)6.51(m,1H),6.44(m,2H),5.80(dd,J＝8.0,2.0Hz,1H),3.56(s,3H)。
实例192
制备N-(4-(5-三氟甲基-2-(3-甲氧基苯基氨基)嘧啶-4-基氨基)苯基)甲基丙烯酰胺I-235
根据实例189中所述的方案、步骤和中间物，在步骤1中使用3-甲氧基苯胺代替2，并在步骤2中使用4-氨基苯基甲基-N-叔丁氧羰基胺代替4，来制备标题化合物。1H NMR(200MHz,CD3OD)δ8.30(s,1H),7.49(d,J＝8.0Hz,1H),7.37(d,J＝8.0Hz,1H),7.10(m,3H),6.60(m,1H)6.34(m,2H),5.75(dd,J＝8.0,2.0Hz,1H),4.51(s,2H),3.68(s,3H)。
实例193
制备N-(4-氯-3-(5-三氟甲基-2-(3-甲氧基苯基氨基)嘧啶-4-基氨基)苯基)丙烯酰胺I-227
根据实例189中所述的方案、步骤和中间物，在步骤1中使用3-甲氧基苯胺代替2，并在步骤2中使用N-叔丁氧羰基-3-氨基-6-氯苯胺代替4，来制备标题化合物。1H NMR(200MHz,CD3OD)δ8.33(s,1H),δ8.08(s,1H),7.45(m,2H),7.21-7.07(m,3H),6.60-6.36(m,3H),5.84(dd,J＝8.0,2.0Hz,1H),3.71(s,3H)。
实例194
制备N-(3-(5-三氟甲基-2-(3-甲氧基苯基氨基)嘧啶-4-基氨基)苯基)甲基丙烯酰胺I-226
根据实例189中所述的方案、步骤和中间物，在步骤1中使用3-甲氧基苯胺代替2，并在步骤2中使用3-氨基苯基甲基-N-叔丁氧羰基胺代替4，来制备标题化合物。1H NMR(200MHz,CD3OD)δ8.31(s,1H),7.71-7.33(m,3H),7.21-7.08(m,4H),6.57(m,1H),6.26(d,J＝4Hz,2H),5.69(dd,J＝8.0,2.0Hz,1H),4.47(s,2H),3.67(s,3H)。
实例195
制备N-(4-(5-三氟甲基-2-(6-甲氧基吡啶-3-基氨基)嘧啶-4-基氨基)苯基)丙烯酰胺I-218
根据实例189中所述的方案、步骤和中间物，在步骤1中使用3-氨基-6-甲氧基吡啶代替2，来制备标题化合物。1H NMR(200MHz,CD3OD)δ8.21(s,1H),7.90-7.78(m,3H),7.48(m,2H),7.30(m,2H),6.40(m,2H),5.75(dd,J＝8.0,2.0Hz,1H),3.81(s,3H)。
实例196
制备N-(4-(5-三氟甲基-2-(5-甲氧基吡啶-3-基氨基)嘧啶-4-基氨基)苯基)丙烯酰胺I-214
根据实例189中所述的方案、步骤和中间物，在步骤1中使用3-氨基-5-甲氧基吡啶代替2，并在步骤2中使用4-氨基-N-叔丁氧羰基苯胺代替4，来制备标题化合物。MS:m/e＝431[M+1]。
实例197
制备1-(3-(5-三氟甲基-2-(3-甲氧基苯基氨基)嘧啶-4-基氨基)苯基)-3-甲基-丁-2-烯-1-酮I-225
根据实例189中所述的方案、步骤和中间物，在步骤1中使用3-甲氧基苯胺代替2，并在步骤2中使用1-(3-氨基苯基)-3-甲基丁-2-烯-1-酮代替4，来制备标题化合物。1H NMR(200MHz,CDCl3)δ8.33(s,1H),δ8.38(s,1H),7.99-7.77(m,4H),7.50(m,2H),7.20-7.01(m,4H),6.68-6.60(m,2H),3.68(s,3H),2.25(s,3H),1.99(s,3H)。
根据下文所述的方案、步骤和中间物，制备1-(3-氨基苯基)-3-甲基丁-2-烯-1-酮。
A)Boc2O，NEt3，DMAP，DCM；B)NHMe(OMe)-HCl，TBTU，DCM，0℃到室温；C)4，THF，0℃到室温；D)TFA，DCM。
步骤1
将二碳酸二叔丁酯(6.54g，30mmol，1.5当量)添加到1(2.70g，20mmol)于含有Et3N(3.4mL，24mmol，1.2当量)和DMAP(122mg，1.0mmol，5mol％)的CH2Cl2(100mL)中的溶液中。在CaCl2干燥管下，搅拌混合物过夜。蒸发溶剂，并使残余物在乙醚(50mL)与水(50mL)之间分配。用乙醚萃取水相，随后用1N HCl酸化到pH 3，并用EtOAc萃取2次，每次50mL。用水和盐水洗涤合并的有机层，并用NaSO4干燥。浓缩得到粗产物，粗产物从EtOAc/己烷中再结晶，得到2(2.92g，62％)。
步骤2
在0℃下，向2(1.5g，6.33mmol)、N-甲氧基-N-甲基胺盐酸盐(614mg，6.33mmol)和TBTU(2.05g，6.33mmol)于DCM(30mL)中的混合物中添加NEt3(2.7mL，19mmol，3当量)。在0℃下搅拌混合物30分钟，随后在室温下搅拌2小时，此时HPLC分析显示反应完成。将反应混合物倒入150mL冷水中，并收集沉淀的白色固体状产物，并用冷水洗涤。在真空烘箱中干燥产物过夜，得到白色固体状的3(1.34g，75％)。
步骤3
在0℃下，于氩气下向3(546mg，1.95mmol)于THF(3mL)中的溶液中逐滴添加4(0.5M的THF溶液，9.75mL，4.9mmol，2.5当量)。在0℃下搅拌反应混合物30分钟，随后移开冷却浴，并在室温下搅拌反应物2小时。将反应混合物冷却到0℃，并用5％柠檬酸溶液淬灭。用水(10mL)稀释，随后用乙醚萃取水相2次，每次15mL，并用水和盐水洗涤合并的有机层，并用NaSO4干燥。浓缩得到黄色固体状的5(82％)，其足够纯从而直接用于下一步骤中。
步骤4
用5mL 1:3的CH2Cl2:三氟乙酸处理400mg的5样品，并在室温下搅拌得到的溶液15分钟。在真空中去除溶剂，并将残余物再溶解于CH2Cl2中，并且再蒸发3次。再将残余物溶解于CH2Cl2中，并用饱和碳酸氢钠溶液洗涤溶液。用硫酸钠干燥CH2Cl2层，过滤并蒸发，得到白色固体状的6，其直接用于下一反应中。
实例198
制备1-(3-(2-(3-甲氧基-苯基氨基)-5-三氟甲基-嘧啶-4-基氨基)-环己基)-3-甲基-丁-2-烯-1-酮I-213
根据实例189中所述的方案、步骤和中间物，在步骤1中使用3-甲氧基苯胺代替2，并在步骤2中使用(d,l)-顺-1-(3-氨基-环己基)-3-甲基-丁-2-烯-1-酮代替4，来制备标题化合物。1H NMR(200MHz,CDCl3)δ8.07(s,1H),7.33(s,1H),7.19-7.0(m,3H),6.54(d,J＝2.7Hz,1H),6.02(s,1H),4.04(m,1H),3.75(s,3H),2.50(m,1H),2.10(m,1H),1.89-1.15(m,14H)。
根据下文所述的方案、步骤和中间物，制备(D,L)-顺-1-(3-氨基-环己基)-3-甲基丁-2-烯-1-酮。
A)Boc2O，Na2CO3，丙酮，H2O；B)NHMe(OMe)-HCl，TBTU，DCM，0℃到室温；C)4，THF，0℃到室温；D)TFA，DCM。
步骤1
向经搅拌的(±)-1(4.05g，28.2mmol)于含有Na2CO3(3.0g，28.2mmol)的水(150mL)和丙酮(100mL)中的溶液中添加BOC2O(7.4g，33.8mmol，1.2当量)，并在25℃下搅拌混合物过夜。汽提去除丙酮，并用乙醚萃取水层2次。将水层酸化到pH 3，并收集沉淀的产物，且用水洗涤。在真空烘箱中干燥产物过夜，得到白色固体状的2(5.90g，85％)。
步骤2
在0℃下，向经搅拌的2(2.45g，10.1mmol)、TBTU(3.44g，10.6mmol，1.05当量)和N-甲基-N-甲氧基胺盐酸盐(1.03g，10.6mmol，1.05eq)于CH2Cl2(40mL)中的溶液中添加三乙胺(4.25mL，30.3mmol，3当量)。在0℃下搅拌混合物20分钟，并移开浴槽，并且在25℃下持续搅拌3小时。用水淬灭后，汽提去除CH2Cl2，并使残余物在乙醚与水之间分配。用乙醚萃取水相，并用水和盐水洗涤合并的有机层，且用MgSO4干燥。蒸发溶剂，得到白色固体状的3(2.37g，82％)。
步骤3
在0℃下，于氩气下向3(1.23g，4.32mmol)于THF(20mL)中的溶液中逐滴添加4(27mL，0.5M的THF溶液，10.8mmol，2.5当量)。添加完成后，在0℃下搅拌混合物30分钟，随后在室温下搅拌1小时。将反应混合物冷却到0℃，随后用5％柠檬酸溶液(5mL)淬灭。用水稀释，随后用乙醚萃取混合物2次，并用水和盐水洗涤合并的有机层，并用NaSO4干燥。蒸发留下橙色残余物，用硅胶使用含20％EtOAc的己烷洗脱，来对其进行色谱分离，得到浅黄色固体状的5(600mg，56％)。
步骤4
用6mL 1:3的CH2Cl2:三氟乙酸处理500mg的5样品，并在室温下搅拌得到的溶液15分钟。在真空中去除溶剂，并将残余物再溶解于CH2Cl2中，并且再蒸发3次。再将残余物溶解于CH2Cl2中，并用饱和碳酸氢钠溶液洗涤溶液。用硫酸钠干燥CH2Cl2层，过滤并蒸发，得到白色固体状的6，其不经纯化即直接使用。
实例199
制备1-(5-(5-三氟甲基-2-(3-甲氧基苯基氨基)嘧啶-4-基)氨基-1,3-二氢异吲哚-2-基)2-丙烯-1-酮I-132
根据实例189中所述的方案、步骤和中间物，在步骤1中使用3-甲氧基苯胺代替2，并在步骤2中使用2-(N-叔丁氧羰基)-5-氨基异吲哚啉代替4，来制备标题化合物。MS m/e＝456[M+1]。
实例200
制备3-(2-(2-丙烯酰基异吲哚啉-5-基氨基)-5-氟嘧啶-4-基氨基)苯甲腈I-106
根据实例2中所述的方案、步骤和中间物，在步骤1中使用5-氟-2,4-二氯嘧啶代替1并用3-氨基苯甲腈代替2，并且在步骤2中使用2-(叔丁氧羰基-5-氨基异吲哚啉代替4，来制备标题化合物。LC/MS(RT＝2.82/(M+H))401.1
实例201
制备N-(3-(5-氟-4-((6-(三氟甲基)吡啶-3-基)甲基氨基)嘧啶-2-基氨基)苯基)丙烯酰胺I-53
根据实例2中所述的方案、步骤和中间物，在步骤1中使用5-氟-2,4-二氯嘧啶代替1，并使用3-氨基甲基-6-三氟甲基吡啶代替2，来制备标题化合物。LC/MS(RT＝2.805/(M+H))433.0
实例202
制备N-(3-(4-((2,3-二氢苯并呋喃-5-基)甲基氨基)-5-氟嘧啶-2-基氨基)苯基)丙烯酰胺I-6
根据实例2中所述的方案、步骤和中间物，在步骤1中使用5-氟-2,4-二氯嘧啶代替1，并使用3-氨基甲基-2,3-二氢苯并呋喃代替2，来制备标题化合物。LC/MS(RT＝2.815/(M+H))406.2
实例203
制备N-(3-(5-氟-2-(4-甲氧基苯甲基氨基)嘧啶-4-基氨基)苯基)丙烯酰胺I-241
根据实例20中所述的方案、步骤和中间物，在步骤2中使用4-甲氧基苯甲基胺代替4，来制备标题化合物。LC/MS(RT＝2.801/(M+H))394.2
实例204
制备N1-(3-(3-(4-(3-丙烯酰胺基苯基氨基)-5-甲基嘧啶-2-基氨基)苯氧基)丙基)-N5-(15-氧代-19-((3aR,4R,6aS)-2-氧代六氢-1H-噻吩并[3,4-d]咪唑-4-基)-4,7,10-三氧杂-14-氮杂十九烷基)戊二酰胺I-215
根据下文所述的方案、步骤和中间物制备标题化合物。
A)TFA，DCM；B)N-生物素基-NH-(PEG)2-COOH-DIPEA，HOBt，EDC，NMM，DMF。
步骤1
将I-45(97mg，0.19mmol；I-45的合成提供于实例62中)溶解于DCM(10mL)中。添加三氟乙酸(200μL)并在室温下搅拌24小时。经由旋转蒸发去除溶剂，得到茶褐色泡沫状物(130mg)，其不经进一步纯化即用于下一反应中。LC/MS(RT＝2.63/(MH+)419.2)
步骤2
将1(80mg，0.15mmoL)溶解于DMF(2mL)中。向混合物中添加N-生物素基-NH-(PEG)2-COOH-DIPEA(114mg，0.16mmol)和HOBt(25mg，0.16mmoL(89％))，并在冰水浴中冷却混合物。添加EDC(32mg，0.16mmoL)，随后添加N-甲基吗啉(50μL，0.45mmoL)。使混合物升温到室温，并持续搅拌30分钟。借助快速色谱法，使用含10％MeOH的DCM的梯度直接纯化，得到40mg黄色薄膜状的I-215。LC/MS(RT＝2.654/(MH+)961.3)。
实例205
制备N-(3-(3-(4-(3-丙烯酰胺基苯基氨基)-5-甲基嘧啶-2-基氨基)苯氧基)丙基)-5-((3aS,4S,6aR)-2-氧代六氢-1H-噻吩并[3,4-d]咪唑-4-基)戊酰胺I-237
根据实例204中所述的方案、步骤和中间物，在步骤2中使用D-(+)-生物素代替N-生物素基-NH-(PEG)2-COOH-DIPEA，来制备标题化合物。LC/MS(RT＝2.686/(M+H))645.2
实例206
制备(R)-N-(3-(5-氟-2-(3-氟-4-(四氢呋喃-3-基氧基)苯基氨基)嘧啶-4-基氨基)苯基)丙烯酰胺I-316
根据实例20中所述的方案、步骤和中间物，在步骤2中使用(R)-3-氟-4-(四氢呋喃-3-基氧基苯胺代替4，来制备标题化合物。1H NMR(DMSO-d6)δppm:1.85-2.00(m,1H),2.20(m,1H),3.70-3.90(m,4H),4.90(s,1H),5.73(dd,J＝1.56&10.04Hz,1H),6.23(dd,J＝1.76&17.00Hz,1H),6.44(dd,J＝10.08&16.88Hz,1H),7.28(t,J＝8.04Hz,1H),7.40-7.47(m,2H),7.67-7.71(m,2H),7.68(dd,J＝1.96&14.08Hz,1H),7.92(s,1H),8.1(d,J＝3.64Hz,1H),9.21(s,1H),9.44(s,1H),10.12(s,1H)；LCMS:m/e 452.0(M-1)。
实例207
制备1-(4-(5-氟-2-(3-氟-4-(2-甲氧基乙氧基)苯基氨基)嘧啶-4-基氨基)苯基)-3-甲基丁-2-烯-1-酮I-325
根据实例112中所述的方案、步骤和中间物，在步骤1中使用4-氨基苯甲酸甲酯代替2，并在步骤2中使用3-氟-4-(2-甲氧基乙氧基)苯胺代替4，来制备标题化合物。1H NMR(DMSO-d6)δppm:2.01(s,3H),2.15(d,J＝0.72Hz,3H),3.31(s,3H),3.66(dd,J＝3.64&4.56Hz,2H),4.11(dd,J＝4.44&6.12Hz,2H),6.93(s,1H),7.08(t,J＝9.44Hz,1H),7.27(d,J＝8.88Hz,1H),7.74(dd,J＝2.44&14.24Hz,1H),7.93(d,J＝8.96Hz,2H),7.98(d,J＝8.92Hz,2H),8.20(d,J＝3.64Hz,1H),9.35(s,1H),9.73(s,1H)；LCMS:m/e 455(M+1)。
实例208
制备1-(3-(5-氟-2-(3-氟-4-(2-甲氧基乙氧基)苯基氨基)嘧啶-4-基氨基)苯基)-3-甲基丁-2-烯-1-酮I-323
根据实例112中所述的方案、步骤和中间物，在步骤2中使用2-(3-氟-4-(2-甲氧基乙氧基)苯胺代替4，来制备标题化合物。1H NMR(DMSO-d6)δppm:1.95(s,3H),2.14(s,3H),3.31(s,3H),3.63(t,J＝4.64Hz,2H),4.06(t,J＝4.36Hz,2H),6.85(bs,1H),6.97(t,J＝9.52Hz,1H),7.26(bd,J＝8.32Hz,1H),7.48(t,J＝7.92Hz,1H),7.62-7.67(m,2H),8.08(bd,J＝7.04Hz,1H),8.15-8.16(m,2H),9.29(s,1H),9.58(s,1H)；LCMS:m/e 455(M+1)。
实例209
制备1-(4-(5-氟-2-(3-氟-4-(2-甲氧基乙氧基)苯基氨基)嘧啶-4-基氨基)苯基)-2-甲基丙-2-烯-1-酮I-324
根据实例112中所述的方案、步骤和中间物，在步骤1中使用4-氨基苯甲酸甲酯代替2，在步骤2中使用3-氟-4-(2-甲氧基乙氧基)苯胺代替4，并在步骤5中使用溴化异丙烯基镁代替8，来制备标题化合物。1H NMR(DMSO-d6)δppm:2.0(s,3H),3.32(s,3H),3.66(t,J＝4.36Hz,2H),4.11(t,J＝4.44Hz,2H),5.55(s,1H),5.94(s,1H),7.07(t,J＝9.32Hz,1H),7.26(t,J＝9.4Hz,1H),7.72-7.76(m,3H),7.99(d,J＝8.44Hz,2H),8.21(d,J＝3.56Hz,1H),9.38(s,1H),9.75(s,1H)；LCMS:m/e 441.2(M+1)。
实例210
制备1-(4-(5-氟-2-(3-氟-4-(2-甲氧基乙氧基)苯基氨基)嘧啶-4-基氨基)苯基)-3-甲基丁-3-烯-2-酮I-329
根据实例112中所述的方案、步骤和中间物，在步骤1中使用4-氨基苯基乙酸乙酯代替2，在步骤2中使用3-氟-4-(2-甲氧基乙氧基)苯胺代替4，并在步骤5中使用溴化异丙烯基镁代替8，来制备标题化合物。1H NMR(DMSO-d6)δppm:1.79(s,3H),3.30(s,3H),3.62-3.65(m,2H),4.06(s,2H),4.08-4.10(m,2H),5.95(d,J＝1Hz,1H),6.27(s,1H),7.01(t,J＝9.44Hz,1H),7.15(d,J＝8.52Hz,2H),7.28(d,J＝8.88Hz,1H),7.64-7.70(m,3H),8.08(d,J＝3.72Hz,1H),9.19(s,1H),9.33(s,1H)；LCMS:m/e 455.3(M+1)。
实例211
制备1-(4-(5-氟-2-(3-氟-4-(2-甲氧基乙氧基)苯基氨基)嘧啶-4-基氨基)苯基)-4-甲基戊-3-烯-2-酮I-331
根据实例112中所述的方案、步骤和中间物，在步骤1中使用4-氨基苯基乙酸乙酯代替2，在步骤2中使用3-氟-4-(2-甲氧基乙氧基)苯胺代替4，来制备标题化合物。1H NMR(DMSO-d6)δppm:1.84(d,J＝1Hz,3H),2.05(d,J＝0.92Hz,3H),3.30(s,3H),3.62-3.64(m,2H),3.68(s,2H),4.07-4.09(m,2H),6.21(t,J＝1.2Hz,1H),7.01(t,J＝8.68Hz,1H),7.16(d,J＝8.48Hz,2H),7.26(d,J＝8.96Hz,1H),7.65-7.72(m,3H),8.08(d,J＝3.72Hz,1H),9.20(s,1H),9.34(s,1H)；LCMS:m/e 469.3(M+1)。
实例212
制备1-(3-(5-氟-2-(3-氟-4-(2-甲氧基乙氧基)苯基氨基)嘧啶-4-基氨基)苯基)-2-甲基丙-2-烯-1-酮I-322
根据实例112中所述的方案、步骤和中间物，在步骤2中使用1,3-氟-4-(2-甲氧基乙氧基)苯胺代替4，并在步骤5中使用溴化异丙烯基镁代替8，来制备标题化合物。1H NMR(DMSO-d6)δppm:1.96(s,3H),3.30(s,3H),3.63(t,J＝4.6Hz,2H),4.07(t,J＝4.36Hz,2H),5.62(s,1H),6.00(s,1H),6.99(t,J＝9.24Hz,1H),7.26(d,J＝8.92Hz,1H),7.39(d,J＝7.56Hz,1H),7.46(t,J＝7.72Hz,1H),7.62(bd,J＝14.4Hz,1H),7.93(s,1H),8.12-8.14(m,2H),9.25(s,1H),9.58(s,1H)；LCMS:m/e 441.2(M+1)。
实例213
制备1-(3-(5-氟-2-(3-氟-4-(2-甲氧基乙氧基)苯基氨基)嘧啶-4-基氨基)苯基)-3-甲基丁-3-烯-2-酮I-328
根据实例112中所述的方案、步骤和中间物，在步骤1中使用3-氨基苯基乙酸乙酯代替2，在步骤2中使用3-氟-4-(2-甲氧基乙氧基)苯胺代替4，并在步骤5中使用溴化异丙烯基镁代替8，来制备标题化合物。1H NMR(DMSO-d6)δppm:1.8(s,3H),3.31(s,3H),3.64(t,J＝4.56Hz,2H),4.06(s,2H),4.09(t,J＝4.37Hz,2H),5.95(s,1H),6.23(s,1H),6.92(d,J＝7.52Hz,1H),7.02(t,J＝9.4Hz,1H),7.27(t,J＝7.8Hz,2H),7.50(s,1H),7.66-7.72(m,2H),8.10(d,J＝3.56Hz,1H),9.21(s,1H),9.36(s,1H)；LCMS:m/e 455.1(M+1)。
实例214
制备2-((3-(5-氟-2-(3-氟-4-(2-甲氧基乙氧基)苯基氨基)嘧啶-4-基氨基)苯基)(羟基)甲基)丙烯腈I-326
根据实例107中所述的方案、步骤和中间物，在步骤2中使用3-氟-4-(2-甲氧基乙氧基)苯胺代替4，来制备标题化合物。1H NMR(DMSO-d6)δppm:3.30(s,3H),3.62-3.65(m,2H),4.09(t,J＝4.6Hz,2H),5.29(d,J＝3.84Hz,1H),6.13(s,1H),6.19(s,1H),6.31(d,J＝4.04Hz,1H),7.03(t,J＝9.24Hz,1H),7.10(d,J＝7.44Hz,1H),7.28(d,J＝8.72Hz,1H),7.36(t,J＝7.8Hz,1H),7.62(s,1H),7.66(dd,J＝2.32&14.44Hz,1H),7.89(d,J＝8.2Hz,1H),8.10(d,J＝3.68Hz,1H),9.14(s,1H),9.45(s,1H)；LCMS:m/e 454(M+1)。
实例215
制备2-((4-(5-氟-2-(3-氟-4-(2-甲氧基乙氧基)苯基氨基)嘧啶-4-基氨基)苯基)(羟基)甲基)丙烯腈I-327
根据实例107中所述的方案、步骤和中间物，在步骤1中使用4-氨基苯甲酸甲酯代替2，并在步骤2中使用3-氟-4-(2-甲氧基乙氧基)苯胺代替4，来制备标题化合物。1H NMR(DMSO-d6)δppm:3.30(s,3H),3.64(dd,J＝2.96&4.56Hz,2H),4.08(t,J＝4.48Hz,2H),5.29(d,J＝3.8Hz,1H),6.11(s,1H),6.21(s,1H),6.24(d,J＝4.12Hz,1H),7.01(t,J＝9.4Hz,1H),7.29-7.34(m,3H),7.68(dd,J＝2.2&14.16Hz,1H),7.77(d,J＝8.52Hz,2H),8.11(d,J＝3.68Hz,1H),9.23(s,1H),9.42(s,1H)；LCMS:m/e 454.0(M+1)。
实例216
制备N-(3-(2-(4-氯-3-(2-羟基-2-甲基丙氧基)苯基氨基)-5-氟嘧啶-4-基氨基)苯基)丙烯酰胺I-249
根据实例20中所述的方案、步骤和中间物，在步骤2中使用4-氯-3-(2-羟基-2-甲基丙氧基)苯胺代替4，来制备标题化合物。1H NMR(DMSO-d6)δppm:1.20(s,6H),3.61(s,2H),4.61(s,1H),5.75(d,J＝11.4Hz,1H),6.24(d,J＝18.36Hz,1H),6.44(dd,J＝10.32&17.08Hz,1H),7.13(d,J＝8.64Hz,1H),7.28(t,J＝8Hz,1H),7.37-7.44(m,3H),7.55(d,J＝7.08Hz,1H),7.93(s,1H),8.12(d,J＝3.44Hz,1H),9.23(s,1H),9.47(s,1H),10.11(s,1H)；LCMS:m/e 472.0(M+1)。
实例217
制备N-(3-(5-氟-2-(3-氟-4-(2-羟基-2-甲基丙氧基)苯基氨基)嘧啶-4-基氨基)苯基)丙烯酰胺I-315
根据实例20中所述的方案、步骤和中间物，在步骤2中使用3-氟-4-(2-羟基-2-甲基丙氧基)苯胺代替4，来制备标题化合物。1H NMR(DMSO-d6)δppm:1.19(s,6H),3.67(s,2H),4.62(s,1H),5.75(d,J＝10.4Hz,1H),6.25(d,J＝17.2Hz,1H),6.45(dd,J＝10&16.8Hz,1H),6.94(t,J＝9.2Hz,1H),7.29(t,J＝8Hz,2H),7.43(d,J＝8.4Hz,1H),7.49(d,J＝7.6Hz,1H),7.67(d,J＝13.6Hz,1H),7.94(s,1H),8.11(d,J＝3.6Hz,1H),9.19(s,1H),9.45(s,1H),10.14(s,1H)；LCMS:m/e 456(M-1)。
实例218
制备N-(3-(5-氟-2-(3-氟-4-(1-羟基丙-2-基氧基)苯基氨基)嘧啶-4-基氨基)苯基)丙烯酰胺I-333
根据实例20中所述的方案、步骤和中间物，在步骤2中使用3-氟-4-(2-羟基-1-甲基乙氧基)苯胺代替4，来制备标题化合物。1H NMR(DMSO-d6)δppm:1.16(d,J＝6.12Hz,3H),3.40-3.46(m,1H),3.50-3.56(m,1H),4.22(六重峰,J＝5.6Hz,1H),4.84(t,J＝5.68Hz,1H),5.75(dd,J＝1.96&10.08Hz,1H),6.25(dd,J＝1.92&16.92Hz,1H),6.46(dd,J＝10.08&16.92Hz,1H),6.98(t,J＝9.32Hz,1H),7.26-7.31(m,2H),7.43(d,J＝8.76Hz,1H),7.49(d,J＝8Hz,1H),7.68(dd,J＝2.44&14.28Hz,1H),7.95(s,1H),8.11(d,J＝3.68Hz,1H),9.23(s,1H),9.46(s,1H),10.17(s,1H)；LCMS:m/e 442.2(M+1)。
实例219
制备N-(3-(2-(4-(2,3-二羟基丙氧基)-3-氟苯基氨基)-5-氟嘧啶-4-基氨基)苯基)丙烯酰胺I-334
根据实例20中所述的方案、步骤和中间物，在步骤2中使用4-(2,3-二羟基丙氧基)-3-氟苯胺代替4，来制备标题化合物。1H NMR(DMSO-d6)δppm:3.42(t,J＝5.6Hz,2H),3.7-3.8(m,1H),3.8-3.9(m,1H),3.94(dd,J＝4.36&9.92Hz,1H),4.65(t,J＝5.64Hz,1H),4.93(d,J＝5.08Hz,1H),5.7-5.8(m,1H),6.24(dd,J＝1.64&16.84Hz,1H),6.44(dd,J＝10&16.96Hz,1H),6.94(t,J＝9.32Hz,1H),7.28(t,J＝7.96Hz,2H),7.40(d,J＝8.28Hz,1H),7.49(d,J＝7.44Hz,1H),7.66(d,J＝14.24Hz,1H),7.92(s,1H),8.09(d,J＝3.6Hz,1H),9.17(s,1H),9.45(s,1H),10.15(s,1H)；LCMS:m/e 456(M-1)。
实例220
制备N-(3-(2-(4-氯-3-(1-羟基-2-甲基丙-2-基氧基)苯基氨基)-5-氟嘧啶-4-基氨基)苯基)丙烯酰胺I-336
根据实例20中所述的方案、步骤和中间物，在步骤2中使用4-氯-3-(1-羟基-2-甲基丙-2-基氧基)苯胺代替4，来制备标题化合物。1H NMR(DMSO-d6)δppm:1.22(s,6H),3.47(d,J＝5.88Hz,2H),4.88(t,J＝5.84Hz,1H),5.75(dd,J＝3.24&10Hz,1H),6.25(dd,J＝2&16.92Hz,1H),6.46(dd,J＝10.12&17.08Hz,1H),7.15(d,J＝8.8Hz,1H),7.31(t,J＝8.2Hz,1H),7.40-7.45(m,1H),7.51-7.60(m,3H),7.93(s,1H),8.13(d,J＝3.56Hz,1H),9.24(s,1H),9.47(s,1H),10.12(s,1H)；LCMS:m/e 472.2(M+1)。
实例221
制备N-(3-(2-(4-氯-3-(1-羟基丙-2-基氧基)苯基氨基)-5-氟嘧啶-4-基氨基)苯基)丙烯酰胺I-337
根据实例20中所述的方案、步骤和中间物，在步骤2中使用4-氯-3-(1-羟基丙-2-基氧基)苯胺代替4，来制备标题化合物。1H NMR(DMSO-d6)δppm:1.18(d,J＝6.12Hz,3H),3.40-3.47(m,1H),3.50-3.56(m,1H),4.20-4.30(m,1H),4.82(t,J＝5.6Hz,1H),5.75(dd,J＝1.88&10.08Hz,1H),6.25(dd,J＝1.92&16.92Hz,1H),6.45(dd,J＝10.08&16.92Hz,1H),7.12(d,J＝8.76Hz,1H),7.29(t,J＝8.08Hz,1H),7.40-7.44(m,3H),7.52(d,J＝8.44Hz,1H),7.91(s,1H),8.12(d,J＝3.64Hz,1H),9.21(s,1H),9.45(s,1H),10.12(s,1H)；LCMS:m/e 458.0(M+1)。
实例222
制备N-(3-(2-(4-(2,3-二羟基丙氧基)苯基氨基)-5-氟嘧啶-4-基氨基)苯基)丙烯酰胺I-335
根据实例20中所述的方案、步骤和中间物，在步骤2中使用4-(1-羟基丙-2-基氧基)苯胺代替4，来制备标题化合物。1H NMR(DMSO-d6)δppm:3.43(dd,J＝0.64&6.84Hz,2H),3.70-3.80(m,2H),3.85-3.95(m,1H),4.62(t,J＝5.6Hz,1H),4.88(d,J＝4.76Hz,1H),5.75(dd,J＝1.76&10.08Hz,1H),6.25(dd,J＝1.72&16.92Hz,1H),6.45(dd,J＝10.08&16.88Hz,1H),6.74(d,J＝9Hz,2H),7.27(t,J＝8.08Hz,1H),7.39(d,J＝8.04Hz,1H),7.38-7.53(m,3H),7.93(s,1H),8.05(d,J＝3.68Hz,1H),8.93(s,1H),9.35(s,1H),10.11(s,1H)；LCMS:m/e 440.3(M+1)。
实例223
制备(R)-N-(3-(2-(4-氯-3-(四氢呋喃-3-基氧基)苯基氨基)-5-氟嘧啶-4-基氨基)苯基)丙烯酰胺I-341
根据实例20中所述的方案、步骤和中间物，在步骤2中使用(R)-4-氯-3-(四氢呋喃-3-基氧基)苯胺代替4，来制备标题化合物。1H NMR(DMSO-d6)δppm:1.85-1.95(m,1H),2.0-2.15(m,1H),3.60-3.70(m,1H),3.73-3.83(m,3H),4.68(s,1H),5.74(dt,J＝1.92&10.0Hz,1H),6.23(dd,J＝1.88&16.92Hz,1H),6.43(dd,J＝10.12&16.96Hz,1H),7.14(d,J＝8.72Hz,1H),7.29(t,J＝8.08Hz,1H),7.33(dd,J＝4.16&8.76Hz,1H),7.41-7.47(m,3H),7.90(s,1H),8.13(d,J＝3.56Hz,1H),9.28(s,1H),9.47(s,1H),10.13(s,1H)；LCMS:m/e469.8(M+1)。
实例224
制备N-(3-(5-氟-2-(3-氟-4-(1-羟基-2-甲基丙-2-基氧基)苯基氨基)嘧啶-4-基氨基)苯基)丙烯酰胺I-332
根据实例20中所述的方案、步骤和中间物，在步骤2中使用3-氟-4-(1-羟基-2-甲基丙-2-基氧基)苯胺代替4，来制备标题化合物。1H NMR(DMSO-d6)δppm:1.13(s,6H),3.36(d,J＝5.84Hz,2H),4.86(t,J＝5.84Hz,1H),5.73(dd,J＝1.96&10.04Hz,1H),6.24(dd,J＝1.96&16.96Hz,1H),6.44(dd,J＝10.08&16.92Hz,1H),6.95(t,J＝9.16Hz,1H),7.23(dd,J＝1.64&8.96Hz,1H),7.28(t,J＝8.12Hz,1H),7.43(d,J＝8.8Hz,1H),7.48(d,J＝7.92Hz,1H),7.70(dd,J＝2.48&13.84Hz,1H),7.92(s,1H),8.11(d,J＝3.68Hz,1H),9.25(s,1H),9.45(s,1H),10.10(s,1H)；LCMS:m/e 456.2(M+1)。
实例225
制备N-(3-(2-(3-(2,3-二羟基丙氧基)苯基氨基)-5-氟嘧啶-4-基氨基)苯基)丙烯酰胺I-339
根据实例20中所述的方案、步骤和中间物，在步骤2中使用3-(2,3-二羟基丙氧基)苯胺代替4，来制备标题化合物。1H NMR(MeOD)δppm:3.59-3.69(m,2H),3.88-3.98(m,3H),5.78(dd,J＝2.16&9.6Hz,1H),6.36(dd,J＝2.24&17.04Hz,1H),6.44(dd,J＝9.56&16.96Hz,1H),6.54-6.57(m,1H),7.08-7.12(m,2H),7.32(t,J＝7.92Hz,2H),7.44(dd,J＝7.88&13.4Hz,2H),7.94(d,J＝3.8Hz,1H),8.09(s,1H)；LCMS:m/e 440.1(M+1)。
实例226
制备N-(4-(5-氟-2-(3-氟-4-(2-甲氧基乙氧基)苯基氨基)嘧啶-4-基氨基)苯基)丙烯酰胺I-351
根据实例20中所述的方案、步骤和中间物，在步骤1中使用叔丁氧羰基氨基-4-氨基苯胺代替2，并在步骤2中使用3-氟-4-(2-甲氧基乙氧基)苯胺代替4，来制备标题化合物。1H NMR(DMSO-d6)δppm:3.30(s,3H),3.63(t,J＝4.6Hz,2H),4.08(t,J＝4.48Hz,2H),5.74(dd,J＝2&10.08Hz,1H),6.25(dd,J＝1.96&16.92Hz,1H),6.44(dd,J＝10.04&16.96Hz,1H),7.02(t,J＝9.48Hz,1H),7.23(bd,J＝7.44Hz,1H),7.64(d,J＝9Hz,2H),7.70-7.74(m,3H),8.07(d,J＝3.72Hz,1H),9.19(s,1H),9.34(s,1H),10.13(s,1H)；LCMS:m/e 442.0(M+1)。
实例227
制备2-((3-(5-氟-2-(6-(2-羟基-2-甲基丙氧基)吡啶-3-基氨基)嘧啶-4-基氨基)苯基)(羟基)甲基)丙烯腈I-312
根据实例107中所述的方案、步骤和中间物，在步骤2中使用3-氨基-6-(2-羟基-2-甲基丙氧基)吡啶代替4，来制备标题化合物。1H NMR(DMSO-d6)δppm:1.18(s,6H),3.98(s,2H),4.61(s,1H),5.31(d,J＝3.88Hz,1H),6.13(s,1H),6.19(s,1H),6.32(d,J＝4Hz,1H),(d,J＝8.88Hz,1H),7.10(d,J＝7.72Hz,1H),7.33(t,J＝7.84Hz,1H),7.68(s,1H),7.84(d,J＝7.52Hz,1H),7.96(dd,J＝2.72&8.88Hz,1H),8.08(d,J＝3.64Hz,1H),8.33(d,J＝Hz,1H),9.06(s,1H),9.44(s,1H)；LCMS:m/e 451(M+1)。
实例228
制备4-(4-(4-(3-丙烯酰胺基苯基氨基)-5-氟嘧啶-2-基氨基)苯氧基)-N-甲基吡啶酰胺I-342
根据实例20中所述的方案、步骤和中间物，在步骤2中使用4-(4-氨基苯氧基)-N-甲基吡啶酰胺代替4，来制备标题化合物。LC/MS(M+H)500.2
实例229
制备(R)-1-(3-(3-氟-4-(2-甲氧基乙氧基)苯基氨基)嘧啶-4-基氨基)哌啶-1-基)丙-2-烯-1-酮I-344
根据实例20中所述的方案、步骤和中间物，在步骤1中使用(R)-1-叔丁氧羰基-3-氨基哌啶代替2，并在步骤2中使用3-氟-4-(2-甲氧基乙氧基)苯胺代替4，来制备标题化合物。LC/MS(M+H)434.1。
实例230
制备(R)-1-(3-(4-(2-甲氧基乙氧基)苯基氨基)嘧啶-4-基氨基)哌啶-1-基)丙-2-烯-1-酮I-345
根据实例20中所述的方案、步骤和中间物，在步骤1中使用(R)-1-叔丁氧羰基-3-氨基哌啶代替2，并在步骤2中使用4-(2-甲氧基乙氧基)苯胺代替4，来制备标题化合物。LC/MS(M+H)416.2
实例231
制备4-(4-(4-(3-丙烯酰胺基苯基氨基)-5-氟嘧啶-2-基氨基)苯氧基)吡啶I-346
根据实例20中所述的方案、步骤和中间物，在步骤2中使用4-(4-氨基苯氧基)吡啶代替4，来制备标题化合物。LC/MS(RT＝2.802/(M+H))500.2
实例232
制备1-((R)-3-(5-氟-2-(4-((S)-四氢呋喃-3-基氧基)苯基氨基)嘧啶-4-基氨基)哌啶-1-基)丙-2-烯-1-酮I-347
根据实例20中所述的方案、步骤和中间物，在步骤1中使用(R)-1-叔丁氧羰基-3-氨基哌啶代替2，并在步骤2中使用4-(S)-(四氢呋喃-3-基氧基)苯胺代替4，来制备标题化合物。LC/MS(M+H)428.3。
实例233
制备1-((R)-3-(5-氟-2-(4-((R)-四氢呋喃-3-基氧基)苯基氨基)嘧啶-4-基氨基)哌啶-1-基)丙-2-烯-1-酮I-348
根据实例20中所述的方案、步骤和中间物，在步骤1中使用(R)-1-叔丁氧羰基-3-氨基哌啶代替2，并在步骤2中使用4-(R)-(四氢呋喃-3-基氧基)苯胺代替4，来制备标题化合物。LC/MS(M+H)428.3。
实例234
制备N-(3-(2-(2,3-二氢苯并[b]1,4]二氧杂环己二烯-6-基氨基)-5-氟嘧啶-4-基氨基)苯基)丙烯酰胺I-349
根据实例20中所述的方案、步骤和中间物，在步骤2中使用6-氨基-2,3-二氢苯并[b]1,4]二噁烷代替4，来制备标题化合物。LC/MS(M+H)408。
实例235
制备1-(6-(4-(3-氯-4-(吡啶-2-基甲氧基)苯基氨基)-5-氟嘧啶-2-基氨基)-2H-苯并[b][1,4]噁嗪-4(3H)-基)丙-2-烯-1-酮I-343
根据实例35中所述的方案、步骤和中间物，在步骤1中使用3-氯-4-(吡啶-2-基甲氧基)苯胺代替2，来制备标题化合物。LC/MS(M+H)533.1。
实例236
制备N-(3-(5-氰基-2-(3-氟-4-(2-甲氧基乙氧基)苯基氨基)嘧啶-4-基氨基)苯基)丙烯酰胺I-350
根据实例94中所述的方案、步骤和中间物，在步骤2中使用3-氟-4-(2-甲氧基乙氧基)苯胺代替4，来制备标题化合物。LC/MS(M+H)449.1
实例237
制备N-(3-(5-三氟甲基-2-(3-氟-4-(2-甲氧基乙氧基)苯基氨基)嘧啶-4-基氨基)苯基)丙烯酰胺I-352
根据实例189中所述的方案、步骤和中间物，在步骤1中使用3-氟-4-(2-甲氧基乙氧基)苯胺代替2，来制备标题化合物。LC/MS(M+H)492.1
实例238
制备N-(3-(2-(4-氯-3-(2-甲氧基乙氧基)苯基氨基)-5-氟嘧啶-4-基氨基)苯基)丙烯酰胺I-321
根据实例20中所述的方案、步骤和中间物，在步骤2中使用4-氯-3-(2-甲氧基乙氧基)苯胺代替4，来制备标题化合物。1H NMR(DMSO-d6)δppm:3.30(s,3H),3.60(t,J＝4.56Hz,2H),3.88(t,J＝3.48Hz,2H),5.74(dd,J＝4.36&10.0Hz,1H),6.24(dd,J＝1.8&16.88Hz,1H),6.44(dd,J＝4.36&10.0Hz,1H),7.13(d,J＝8.72Hz,1H),7.28(t,J＝8.04Hz,1H),7.33(dd,J＝2.16&8.8Hz,1H),7.41(d,J＝7.96Hz,1H),7.47-7.49(m,2H),7.84(s,1H),8.13(d,J＝3.6Hz,1H),9.27(s,1H),9.47(s,1H),10.12(s,1H)；LCMS:m/e458.0(M+1)。
实例239
制备N-(3-(5-氟-2-(6-(2-羟基-2-甲基丙氧基)吡啶-3-基氨基)嘧啶-4-基氨基)苯基)丙烯酰胺I-313
根据实例20中所述的方案、步骤和中间物，在步骤2中使用3-氨基-6-(2-羟基-2-甲基丙氧基)吡啶代替4，来制备标题化合物。1H NMR(DMSO-d6)δppm:1.16(s,6H),3.93(s,2H),4.57(s,1H),5.74(dd,J＝1.68&10.04Hz,1H),6.24(dd,J＝1.84&16.92Hz,1H),6.45(dd,J＝10.04&16.88Hz,1H),6.65(d,J＝8.88Hz,1H),7.26(t,J＝8.04Hz,1H),7.39(d,J＝8Hz,1H),7.48(d,J＝7.8Hz,1H),7.91(s,1H),7.99(dd,J＝2.72&8.92Hz,1H),8.07(d,J＝3.68Hz,1H),8.27(d,J＝2.52Hz,1H),9.06(s,1H),9.41(s,1H),10.1(s,1H)；LCMS:m/e439.0(M+1)。
实例240
制备N-(3-(5-氟-2-(3-氟-4-(3-(甲磺酰基)丙氧基)苯基氨基)嘧啶-4-基氨基)苯基)丙烯酰胺I-318
根据实例20中所述的方案、步骤和中间物，在步骤2中使用3-氟-4-(3-(甲磺酰基)丙氧基)苯胺代替4，来制备标题化合物。1H NMR(DMSO-d6)δppm:2.05-2.15(m,2H),3.01(s,3H),3.24(t,J＝7.56Hz,2H),4.05(t,J＝6.12Hz,2H),5.74(dd,J＝1.84&9.72Hz,1H),6.24(dd,J＝1.72&16.96Hz,1H),6.44(dd,J＝10&16.84Hz,1H),6.96(t,J＝9.36Hz,1H),7.28(t,J＝8.04Hz,2H),7.40(d,J＝7.8Hz,1H),7.48(d,J＝8.32Hz,1H),7.69(dd,J＝2.2&14.4Hz,1H),7.91(s,1H),8.10(d,J＝3.64Hz,1H),9.20(s,1H),9.44(s,1H),10.12(s,1H)；LCMS:m/e 504.2(M+1)。
实例241
制备1-(3-(5-氟-2-(3-氟-4-(2-甲氧基乙氧基)苯基氨基)嘧啶-4-基氨基)苯基)-4-甲基戊-3-烯-2-酮I-330
根据实例112中所述的方案、步骤和中间物，在步骤1中使用4-氨基甲基苯甲酸乙酯代替2，并在步骤2中使用3-氟-4-(2-甲氧基乙氧基)苯胺代替4，来制备标题化合物。1HNMR(DMSO-d6)δppm:1.83(s,3H),2.05(s,3H),3.31(s,3H),3.64(t,J＝4.56Hz,2H),3.69(s,2H),4.08(t,J＝4.4Hz,2H),6.18(s,1H),6.92(d,J＝7.44Hz,1H),7.01(t,J＝9.36Hz,1H),7.27(t,J＝7.84Hz,2H),7.51(s,1H),7.64-7.71(m,2H),8.09(d,J＝3.64Hz,1H),9.19(s,1H),9.34(s,1H)；LCMS:m/e 469.1(M+1)。
实例242
制备N-(3-(2-(4-氯-3-(2,3-二羟基丙氧基)苯基氨基)-5-氟嘧啶-4-基氨基)苯基)丙烯酰胺I-353
根据下文所述的方案、步骤和中间物制备标题化合物。
A)Pd(OAc)2，BINAP，Cs2CO3，甲苯，110℃16小时；B)TFA，CH2Cl2，室温，2小时；C)丙烯酰氯，K2CO3，NMP，室温，45分钟。
步骤1
在100℃下，于氮气氛围下将2(200mg，0.77mmol)、1(262mg，0.77mmol)、Pd(OAc)2(17.3mg，0.07mmol)、BINAP(24mg，0.038mmol)和Cs2CO3(630mg，1.9mmol)于经过脱气的甲苯(用氮气净化甲苯30分钟)中的溶液加热16小时。冷却反应混合物，用EtOAc(15mL)稀释，并经过滤。用水(5mL)和盐水(3mL)洗涤滤液，用Na2SO4干燥，过滤并在减压下浓缩，得到黄色固体状的3(0.3g，69％)。
步骤2
在0℃下，向经搅拌的3(300mg，0.5mmol)于无水CH2Cl2(6mL)中的溶液中添加CF3COOH(3mL)，并在此温度下保持反应混合物30分钟。使反应物达到室温，并在此温度下搅拌3小时。在减压下浓缩反应混合物，并用水(5mL)淬灭残余物，用NaCO3溶液碱化，并用乙酸乙酯萃取2次，每次10mL。用水(5mL)和盐水(5mL)洗涤合并的萃取物，用Na2SO4干燥并在减压下浓缩，得到黄色固体状的4(200mg，88％)。
步骤3
在0℃下，向经搅拌的4(240mg，0.5mmol)于NMP(1.5mL)中的溶液中添加碳酸钾(780mg，5.7mmol)和丙烯酰氯(57mg，0.5mmol)，并在0℃下搅拌反应混合物3小时。在室温下再搅拌反应混合物30分，并通过逐滴添加搅拌的冷10％NaHCO3溶液淬灭反应，并在0℃下搅拌30分钟。沉淀析出固体，并通过经布氏漏斗过滤进行分离。用冷水洗涤固体，将其溶解于EtOAc(20mL)中，并通过使用三乙胺进行碱化，且用水(2mL)、盐水(1mL)洗涤，用Na2SO4干燥并在减压下浓缩。借助制备型HPLC纯化残余物，得到白色固体状的标题化合物(45mg，15.5％)。1H NMR(DMSO-d6)δppm:3.43-3.50(m,2H),3.78-3.85(m,2H),3.89-3.92(m,1H),4.65(t,J＝5.6Hz,1H),4.93(d,J＝4.8Hz,1H),5.76(dd,J＝1.92&10.04Hz,1H),6.26(dd,J＝1.92&16.92Hz,1H),6.46(dd,J＝10.08&16.92Hz,1H),7.14(d,J＝8.72Hz,1H),7.30(t,J＝8.08Hz,1H),7.39-7.43(m,2H),7.46(dd,J＝2.2&8.72Hz,1H),7.56(d,J＝8.04Hz,1H),7.94(s,1H),8.14(d,J＝3.6Hz,1H),9.24(s,1H),9.48(s,1H),10.13(s,1H)；LCMS:m/e473.8(M+)。
合成中间物2
A)DIAD，PPh3，Et3N，无水THF，室温，1小时；B)H2，Ra Ni，甲醇，2小时。
步骤1
在氮气氛围下，向经搅拌的2'(0.640g，3.7mmol)于THF(20mL)中的溶液中添加1'(0.5g，3.7mmol)、PPh3(1.09g，4.1mmol)和Et3N(0.73g，5.6mmol)。将反应混合物冷却到0℃，并添加DIAD(0.84g，4.1mmol)。使反应混合物达到室温，并搅拌1小时。用水淬灭反应，用乙酸乙酯萃取3次，每次10mL，并用水和盐水溶液(各5mL)洗涤合并的萃取物。借助管柱色谱法(SiO2，60-120，石油醚/乙酸乙酯，9/1)纯化在减压下浓缩后得到的残余物，得到白色固体状的3'(0.6g，60％)。
步骤2
在氮气下，向3'(0.3g，1.04mmol)的甲醇溶液中添加雷尼镍(Raney Ni)(60mg，以重量比计20％)，并在氢气氛围(气囊压力)下保持反应混合物16小时。使反应混合物经床过滤并在减压下浓缩滤液。用1.5N HCl(2mL)稀释残余物，并用乙酸乙酯(5mL)洗涤，以去除有机杂质。用NaHCO3溶液(5mL)碱化水层，用乙酸乙酯萃取，用水(2mL)和盐水(2mL)洗涤，并用无水Na2SO4干燥。过滤，随后在减压下浓缩，得到褐色液体状的2(0.2g，76.9％)。
实例243
制备(S)-N-(3-(2-(4-氯-3-(四氢呋喃-3-基氧基)苯基氨基)-5-氟嘧啶-4-基氨基)苯基)丙烯酰胺I-354
根据实例20中所述的方案、步骤和中间物，在步骤2中使用(S)-4-氯-3-(四氢呋喃-3-基氧基)苯胺代替4，来制备标题化合物。LCMS:m/e 469.8(M+1)。
实例244
制备(N-(3-(5-氟-2-(3-氟-4-(((2S,4R)-4-羟基吡咯烷-2-基)甲氧基)苯基氨基)嘧啶-4-基氨基)苯基)丙烯酰胺I-355
根据下文所述的方案、步骤和中间物制备标题化合物。
A)Pd(OAc)2，BINAP，Cs2CO3，甲苯，110℃，6小时；B)TFA，CH2Cl2，室温，1小时；C)(Boc)2O，30分钟，随后丙烯酰氯，K2CO3，NMP，0℃，90分钟；D)HF(49％水溶液)，CH3CN，室温，2小时；E)TFA，DCM，室温，2小时。
步骤1
在110℃下，于氮气氛围下将2(0.50g，1.13mmol)、1(0.30g，1.13mmol)、Pd(OAc)2(0.0025g，0.1mmol)、BINAP(0.0035g，0.05mmol)和Cs2CO3(0.92g，2.8mmol)于经过脱气的甲苯(用氮气净化甲苯30分钟)中的溶液加热16小时。冷却反应混合物，用EtOAc(20mL)稀释，用水(10mL)、盐水(10mL)洗涤，并用Na2SO4干燥。过滤，随后在减压下浓缩得到残余物，用己烷进一步洗涤残余物，得到黄色固体状的3(0.3g，42.8％)。
步骤2
向3(0.3g，0.44mmol)于甲醇(5mL)中的溶液中添加Pd/C(0.030g，以重量比计10％)，并在室温下，于氢气氛围(气囊)下搅拌反应混合物16小时。反应混合物经垫过滤，并在减压下浓缩，得到黄色固体状的4(0.19g，67.6％)。
步骤3
在室温下，向经搅拌的4(0.1g，0.15mmol)于NMP(1.0mL)中的溶液中添加Boc酐(0.046g，0.212mmol)，并在室温下搅拌反应混合物60分钟。随后将其冷却到0℃，并向其中添加K2CO3(0.107g，0.77mmol)、丙烯酰氯(0.016g，0.18mmol)，并且在0℃下搅拌反应混合物90分钟。将反应混合物逐滴添加到搅拌的冷10％NaHCO3溶液中。添加完成后，在0℃下再搅拌溶液30分钟，并通过经布氏漏斗过滤分离出固体。用冷水、己烷洗涤固体，并将其溶解于甲醇:二氯甲烷(50:50，10mL)中，且在减压下浓缩。将得到的残余物悬浮于冷水(5mL)中，向其中添加Et3N，并用乙酸乙酯萃取2次，每次10mL。用水(5mL)、盐水(5mL)洗涤合并的乙酸乙酯萃取物，用Na2SO4干燥并在减压下浓缩。借助管柱色谱法(SiO2，甲醇/氯仿：4/96)进一步纯化残余物，得到黄色固体状的5(0.075g，71.4％)。
步骤4
在0℃下，向5(15mg，0.02mmol)的丙烯腈溶液中添加HF(49％水溶液，0.0048mL，0.024mmol)。在室温下搅拌反应混合物2小时，用乙酸乙酯(2mL)萃取，用水(1mL)洗涤，并用Na2SO4干燥，并过滤。在减压下浓缩滤液。LCMS显示残余物纯度为60％，并且不经进一步纯化即用于下一步骤。
步骤5
在0℃下，向经搅拌的6(0.008g，0.013mmol)于CH2Cl2(0.024mL)中的溶液中添加TFA(0.016mL)。使反应混合物达到室温，并且再搅拌2小时。随后将其浓缩，并与冷的10％NaHCO3(1.0mL)一起搅拌。将其用EtOAc萃取2次，每次2mL，并用盐水(1mL)洗涤合并的EtOAc萃取物，用Na2SO4干燥并在减压下浓缩。借助管柱色谱法(SiO2，甲醇/氯仿：2/98)进一步纯化粗残余物，随后借助制备型TLC纯化，得到白色固体状的标题化合物(2mg，HPLC显示纯度为81％，且LCMS显示纯度为79％)。LCMS:m/e 483(M+)。
根据下文所述的方案、步骤和中间物制备化合物2。
A)MeOH，SOCl2，回流，5小时；B)(Boc)2O，Et3N，CH2Cl2，室温，5小时；C)TBDMS-Cl，咪唑，DMF，室温，16小时；D)LAH溶液(1M的THF溶液)，-20℃，20分钟；E)DIAD，PPh3，Et3N，THF，16小时；F)H2，Pd/C，甲醇，室温，16小时。
步骤1
向经搅拌的1'(2g，15.26mmol)的溶液中添加通过将亚硫酰氯(2mL)添加到甲醇(20mL)中所制备的溶液。在回流下加热反应混合物5小时。反应完成后，在减压下去除甲醇，得到呈无色盐形式的2'(3.0g)，其以原样用于下一反应中。
步骤2
向经搅拌的2'(3.0g，12.24mmol)于DCM(30mL)中的溶液中添加Et3N(1.85g，18.31mmol)和Boc酐(2.92g，13.46mmol)。在室温下持续搅拌5小时，随后用水淬灭反应。分离有机层，干燥并在减压下浓缩。借助管柱色谱法(SiO2，60-120，100％乙酸乙酯)纯化残余物，得到白色固体状的3'(3.2g，64％)。
步骤3
向经搅拌的3'(3g，12.24mmol)于DMF(30mL)中的溶液中依次添加咪唑(1.2g，18.36mmol)和叔丁基二甲基氯硅烷(TBDMS chloride)(1.84g，12.24g)。持续搅拌16小时。用乙酸乙酯(50mL)稀释反应混合物，并分离乙酸乙酯层。乙酸乙酯层用水(5mL)、盐水溶液(5mL)洗涤，并用Na2SO4干燥。过滤，随后在减压下浓缩，得到残余物，借助管柱色谱法(SiO2，60-120，石油醚/乙酸乙酯：6/4)纯化，得到无色液体状的4'(3.2g，80％)。
步骤4
在-20℃下，向经搅拌的4'(0.5g，1.39mmol)于THF(5mL)中的溶液中添加LAH(1.39mL，1M溶液，1.39mmol)。在相同温度下持续反应15分钟，随后用Na2SO4溶液淬灭。反应物经过滤，并在减压下浓缩滤液。用乙酸乙酯(10mL)稀释残余物，用无水Na2SO4干燥，过滤并在减压下浓缩，得到无色液体状的5'(0.3g，65％)。
步骤5
在氮气氛围下，向经搅拌的5'(0.1g，0.3mmol)于THF(6mL)中的溶液中添加6'(0.047g，0.3mmol)、PPh3(0.16g，0.64mmol)和Et3N(0.048g，0.48mmol)。将反应混合物冷却到0℃，并向其中添加DIAD(0.094g，0.48mmol)。使反应混合物达到室温，并在此温度下搅拌1小时。用水淬灭反应混合物，用乙酸乙酯萃取2次，每次5mL，并用水和盐水溶液(各5mL)洗涤合并的乙酸乙酯萃取物。借助管柱色谱法(SiO2，60-120，石油醚/乙酸乙酯，9/1)纯化在减压下浓缩后得到的残余物，得到黄色固体状的7'(0.120g，85％)。
步骤6
向7'(0.1g，0.21mmo)于甲醇(5mL)中的溶液中添加Pd/C(0.010g，以重量比计10％)，并在室温下，于氢气氛围(气囊)下搅拌反应混合物16小时。反应混合物经垫过滤，并在减压下浓缩，得到微褐色粘稠油状的2(0.085g，91％)。其不经进一步纯化即用于下一步骤中。
实例245
制备2-(2-(4-(4-(3-丙烯酰胺基苯基氨基)-5-氟嘧啶-2-基氨基)-2-氟苯氧基)乙氧基)乙基氨基甲酸叔丁酯I-356
根据下文所述的方案、步骤和中间物制备标题化合物。
A)Pd(OAc)2，BINAP，Cs2CO3，甲苯，110℃，6小时；B)TFA，CH2Cl2，室温1小时；C)(Boc)2O，30分钟，随后丙烯酰氯，K2CO3，NMP，0℃，90分钟。
步骤1
在110℃下，于氮气氛围下将2(0.050g，0.159mmol)、1(0.053g，0.159mmol)、Pd(OAc)2(0.0035g，0.01590mmol)、BINAP(0.0049g，0.0079mmol)和Cs2CO3(0.129g，0.3975mmol)于经过脱气的甲苯(用氮气净化甲苯30分钟)中的溶液加热16小时。冷却反应混合物，用EtOAc(20mL)稀释，用水(10mL)、盐水(10mL)洗涤，并用Na2SO4干燥。过滤，随后在减压下浓缩，得到残余物，用己烷进一步洗涤残余物，得到褐色固体状的3(0.049g，50％)。
步骤2
在0℃下，向经搅拌的3(0.047g，0.0762mmol)于无水CH2Cl2(3mL)中的溶液中添加CF3COOH(1.0mL)，并在0℃下搅拌反应混合物30分钟。使反应物达到室温，并在此温度下搅拌1小时。在减压下浓缩反应物，并用NaHCO3溶液(3mL)淬灭残余物。用乙酸乙酯萃取内含物3次，每次10mL，并用水(10mL)洗涤合并的EtOAc萃取物，随后用10％柠檬酸溶液洗涤3次，每次10mL。用10％NaOH溶液碱化合并的柠檬酸萃取物，并用EtOAc萃取3次，每次25mL。用水(20mL)、盐水(10mL)洗涤EtOAc萃取物，并用Na2SO4干燥，得到浅黄色固体状的4(0.028g，88％)。
步骤3
在室温下，向经搅拌的4(0.028g，0.06731mmol)于NMP(1.0mL)中的溶液中添加(Boc)2O(0.016g，0.07404mmol)，并在室温下搅拌反应混合物30分钟。将其冷却到0℃，并向其中添加K2CO3(0.051g，0.372mmol)和丙烯酰氯(0.0067g，0.07404mmol)，并且在0℃下搅拌反应混合物30分钟。将反应混合物逐滴添加到搅拌的冷10％NaHCO3溶液中。添加完成后，在0℃下再搅拌溶液30分钟，并通过经布氏漏斗过滤分离出固体。用冷水、己烷洗涤固体，并将其溶解于甲醇:二氯甲烷(50:50，5mL)中，且在减压下浓缩。将得到的残余物悬浮于冷水(3mL)中，向其中添加Et3N，并用乙酸乙酯萃取2次，每次5mL。用水(5mL)、盐水(5mL)洗涤合并的乙酸乙酯萃取物，用Na2SO4干燥并在减压下浓缩，得到灰色固体状的标题化合物(0.016g，42％)。1H NMR(DMSO-d6)δppm:1.37(s,9H),3.09(d,J＝5.5Hz,2H),3.43(d,J＝5.84Hz,2H),3.69(s,2H),4.05(s,2H),5.75(d,J＝11.12Hz,1H),6.25(d,J＝16.76Hz,1H),6.46(dd,J＝10.12&16.84Hz,1H),6.81(s,1H),6.96(t,J＝9.12Hz,1H),7.24-7.31(m,2H),7.43(d,J＝7.96Hz,1H),7.49(d,J＝7.56Hz,1H),7.68(d,J＝14Hz,1H),7.94(s,1H),8.11(d,J＝3.24Hz,1H),9.21(s,1H),9.46(s,1H),10.15(s,1H)；LCMS:m/e 571.1(M+1)。
根据下文所述的方案、步骤和中间物制备中间物2。
A)(Boc)2O，NaOH水溶液，室温，16小时；B)DIAD，PPh3，Et3N，无水THF，室温，1小时；C)H2，Pd/C，乙醇，室温，16小时。
步骤1
在室温下，向NaOH(0.76g，0.019mmol)于水(9.6mL)中的溶液中添加1'(2.0g，19.022mmol)，并搅拌反应物30分钟。经5分钟向其中逐滴添加Boc酐(4.561g，20.92mmol)于THF(12.0mL)中的溶液。在室温下搅拌反应混合物16小时。在减压下浓缩反应混合物，用水(20mL)稀释，并用EtOAc萃取4次，每次50mL。用水(50mL)、盐水(50mL)洗涤合并的EtOAc萃取物，用Na2SO4干燥，得到粘稠油状的2'(3.2g，82％)。
步骤2
在氮气氛围下，向经搅拌的2'(0.38g，1.851mmol)于THF(6mL)中的溶液中添加3'(0.29g，1.851mmol)、PPh3(0.534g，2.0361mmol)和Et3N(0.280g，2.776mmol)。将反应混合物冷却到0℃，并向其中添加DIAD(0.411g，2.0361mmol)。使反应混合物达到室温，并在此温度下搅拌1小时。用水淬灭反应混合物，用乙酸乙酯萃取3次，每次5mL，并用水和盐水溶液(各5mL)洗涤合并的乙酸乙酯萃取物。借助管柱色谱法(SiO2，60-120，石油醚/乙酸乙酯，9/1)纯化在减压下浓缩后得到的残余物，得到黄色固体状的4'(0.360g，粗品)。
步骤3
向4'(0.360g，1.0456mmol)于乙醇(10mL)中的溶液中添加Pd/C(0.072g，以重量比计20％)，并在室温下，于氢气氛围(1.5Kg氢气压力)下搅拌反应混合物16小时。反应混合物经垫过滤，并在减压下浓缩，得到微褐色粘稠油状的2(0.28g，85％)。其不经进一步纯化即用于下一步骤中。
实例246
制备N1-(2-(2-(4-(4-(3-丙烯酰胺基苯基氨基)-5-氟嘧啶-2-基氨基)-2-氟苯氧基)乙氧基)乙基)-N5-(15-氧代-18-((3aR,4R,6aS)-2-氧代六氢-1H-噻吩并[3,4-d]咪唑-4-基)-4,7,10-三氧杂-14-氮杂十八烷基)戊二酰胺I-362
根据实例204中所述的方案、步骤和中间物，在步骤1中使用2-(2-(4-(4-(3-丙烯酰胺基苯基氨基)-5-氟嘧啶-2-基氨基)-2-氟苯氧基)乙氧基)乙基氨基甲酸叔丁酯(I-356，如实例245中所述)代替I-45，来制备标题化合物。1H NMR(DMSO-d6)δppm:10.1(s,1H),9.87(s,1H),9.52(s,1H),8.09(d,J＝4.1Hz,1H),7.86(s,1H),7.78(t,J＝5.5Hz,1H),7.66(m,3H),7.48(dd,J＝2.3&13.8Hz,1H),7.33(m,2H),7.21(t,.7＝7.8Hz,1H),7.11(d,J＝9.2Hz,1H),6.90(t,J＝9.2Hz,1H),6.34(m,2H),6.14(dd,J＝2.3&17.0Hz,1H),5.66(dd,J＝2.3&17.0Hz,1H),4.20(dd,J＝5.0&7.3Hz,1H),3.99(m,3H),3.61(m,2H),3.12(q,J＝6.0Hz,2H),2.97(m,9H),2.72(m,2H),2.46(m,2H),1.95(m,9H),1.1-1.6(m,18H)；LCMS:m/e1013.(M+1)。
实例247
制备N-(3-(5-氟-2-(3-氟-4-(2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基)-苯基氨基)嘧啶-4-基氨基)苯基)丙烯酰胺I-359
根据下文所述的方案、步骤和中间物制备标题化合物。
A)DIAD，PPh3，Et3N，无水THF，室温，1小时；B)H2，Pd/C，甲醇，室温，16小时；C)Pd(OAc)2，BINAP，Cs2CO3，甲苯，110℃，6小时；D)TFA，CH2Cl2，室温，1小时；E)(BOC)2O，30分钟，随后K2CO3，NMP，0℃，15分钟。
步骤1
在氮气氛围下，向经搅拌的1(0.5g，3.18mmol)于THF(10mL)中的溶液中添加2(0.38g，3.18mmol)、PPh3(0.91g，3.498mmol)和Et3N(0.48g，4.776mmol)。将反应混合物冷却到0℃，并向其中添加DIAD(0.707g，3.5mmol)。使反应混合物达到室温，并在此温度下搅拌1小时。用水淬灭反应混合物，用乙酸乙酯萃取3次，每次5mL，并用水和盐水溶液(各5mL)洗涤合并的EtOAc萃取物。借助管柱色谱法(SiO2，60-120，石油醚/乙酸乙酯，7/3)纯化在减压下浓缩后得到的残余物，得到白色固体状的3(0.61g，65％)。
步骤2
向3(0.6g，2.31mmol)于乙醇(20mL)中的溶液中添加Pd/C(0.060g，以重量比计10％)，并在室温下，于氢气氛围(气囊压力)下搅拌反应混合物16小时。反应混合物经垫过滤，并在减压下浓缩，得到微褐色粘稠油状的4(0.375g，70.7％)。
步骤3
在110℃下，于氮气氛围下将4(0.275g，1.19mmol)、根据实例20步骤1制备的5(0.403g，1.19mmol)、Pd(OAc)2(0.0026g，0.11mmol)、BINAP(0.0037g，0.059mmol)和Cs2CO3(0.969g，2.95mmol)于经过脱气的甲苯(用氮气净化甲苯30分钟)中的溶液加热16小时。冷却反应混合物，用EtOAc(20mL)稀释，用水(10mL)、盐水(10mL)洗涤，并用Na2SO4干燥。过滤，随后在减压下浓缩，得到残余物，借助管柱色谱法(SiO2，60-120，石油醚/乙酸乙酯5/5)进一步纯化残余物，得到黄色固体状的6(0.350g，55％)。
步骤4
在0℃下，向经搅拌的6(0.3g，0.56mmol)于无水CH2Cl2(3mL)中的溶液中添加CF3COOH(1.0mL)，并在0℃下搅拌反应混合物30分钟。使反应物达到室温，并在此温度下搅拌1小时。在减压下浓缩反应物，并用NaHCO3溶液(3mL)淬灭残余物，并且用EtOAc萃取3次，每次25mL。用水(20mL)、盐水(10mL)洗涤合并的EtOAc萃取物，并用Na2SO4干燥，得到浅褐色粘稠液体状的7(0.15g，62.5％)。
步骤5
在约0℃下，向冷却的7(0.1g，0.23mmol)于NMP(1.0mL)中的溶液中添加K2CO3(0.15g，1.1mmol)、丙烯酰氯(0.0022g，0.25mmol)，并在0℃下搅拌反应混合物30分钟。将反应混合物逐滴添加到搅拌的冷10％NaHCO3溶液中。添加完成后，在0℃下再搅拌溶液30分钟，并通过经布氏漏斗过滤分离出固体。用冷水、己烷洗涤固体，并将其溶解于甲醇:二氯甲烷(50:50，25mL)中，且在减压下浓缩。将得到的残余物悬浮于冷水(3mL)中，向其中添加Et3N，并用乙酸乙酯萃取2次，每次5mL。用水(5mL)、盐水(5mL)洗涤合并的乙酸乙酯萃取物，用Na2SO4干燥并在减压下浓缩，得到黄色固体状的标题化合物(0.055g，50％)。1H NMR(DMSO-d6)δppm:3.24(s,3H),3.44(t,J＝4.88Hz,2H),3.57(t,J＝4.04Hz,2H),3.69(t,J＝4.24Hz,2H),4.04(t,J＝4.04Hz,2H),5.73(d,J＝10.12Hz,1H),6.23(d,J＝16.8Hz,1H),6.45(dd,J＝10.12&16.92Hz,1H),6.95(t,J＝9.4Hz,1H),7.28-7.30(m,2H),7.42(d,J＝8.04Hz,1H),7.48(d,J＝7.48Hz,1H),7.67(d,J＝14.36Hz,1H),7.93(s,1H),8.10(d,J＝3.44Hz,1H),9.20(s,1H),9.44(s,1H),10.14(s,1H)；LCMS:m/e 486.1(M+1)。
实例248
制备(S)-N-(3-(2-(4-氯-3-(1-羟基丙-2-基氧基)苯基氨基)-5-氟嘧啶-4-基氨基)苯基)丙烯酰胺I-357
根据下文所述的方案、步骤和中间物制备标题化合物。
A)TBDMSCl，咪唑，CH2Cl2，0℃，2小时；B)DIAD，PPh3，Et3N，无水THF，室温，1小时；C)H2，雷尼镍，MeOH，2小时；D)Pd(OAc)2，BINAP，Cs2CO3，甲苯，110℃，6小时；E)TFA，CH2Cl2，室温，1小时；F)(BOC)2O，30分钟，随后K2CO3，NMP，0℃，15分钟。
步骤1
在0℃下，向经搅拌的1(1g，13.1mmol)的DCM溶液中添加咪唑(0.875g，13.1mmol)和叔丁基二甲基氯硅烷(1.98g，13.1mmol)。保持相同温度2小时，随后过滤反应混合物并浓缩。借助管柱色谱法(中性氧化铝，石油醚/乙酸乙酯7/3)纯化残余物，得到无色液体状的2(1.4g，56％)。
步骤2
在氮气氛围下，向经搅拌的2(1.5g，7.89mmol)于THF(15mL)中的溶液中添加3(1.36g，7.89mmol)、PPh3(2.27g，8.6mmol)和Et3N(1.19g，11.1mmol)。将反应混合物冷却到0℃，并向其中添加DIAD(1.75g，8.6mmol)。使反应混合物达到室温，并在此温度下搅拌1小时。用水淬灭反应混合物，用乙酸乙酯萃取3次，每次5mL，并用水和盐水溶液(各5mL)洗涤合并的EtOAc萃取物。借助管柱色谱法(SiO2，60-120，石油醚/乙酸乙酯，7/3)纯化在减压下浓缩后得到的残余物，得到黄色油状的4(2.1g，76.9％)。
步骤3
向4(2g，5.7mmol)于甲醇(20mL)中的溶液中添加雷尼镍(3g)。在室温下，于氢气氛围(气囊压力)下搅拌反应混合物2小时。反应混合物经垫过滤，并在减压下浓缩，且借助管柱色谱法(中性氧化铝，石油醚/乙酸乙酯，8/2)纯化残余物，得到微褐色粘稠油状的5(1.4g,，77％)。
步骤4
在110℃下，于氮气氛围下将根据实例20步骤1制备的6(0.2g，0.63mmol)、1(0.213.g，0.63mmol)、Pd(OAc)2(0.014g，0.063mmol)、BINAP(0.0019g，0.031mmol)和Cs2CO3(0.511g，1.5mmol)于经过脱气的甲苯(用氮气净化甲苯30分钟)中的溶液加热16小时。冷却反应混合物，用EtOAc(20mL)稀释，用水(10mL)、盐水(10mL)洗涤，并用Na2SO4干燥。过滤，随后在减压下浓缩，得到残余物，使用管柱色谱法(SiO2，60-120，石油醚/乙酸乙酯7/3)进一步纯化残余物，得到黄色固体状的7(0.15g，38.4％)。
步骤5
在0℃下，向经搅拌的7(0.15g，0.24mmol)于无水CH2Cl2(5mL)中的溶液中添加CF3COOH(1.5mL)，并在0℃下搅拌反应混合物30分钟。使反应物达到室温，并在此温度下搅拌1小时。在减压下浓缩反应物，并用NaHCO3溶液(3mL)淬灭残余物，并且用EtOAc萃取3次，每次25mL。用水(20mL)、盐水(10mL)洗涤合并的EtOAc萃取物，并用Na2SO4干燥，且在减压下浓缩，得到白色固体状的8(0.085g，86.7％)。
步骤6
将经搅拌的8(0.085g，0.21mmol)于NMP(2.0mL)中的溶液冷却到0℃，并向其中添加K2CO3(0.29g，2.1mmol)和丙烯酰氯(1M的THF溶液，0.21mL，0.21mmol)，并在0℃下搅拌反应混合物30分钟。将反应混合物逐滴添加到搅拌的冷10％NaHCO3溶液中。添加完成后，在0℃下再搅拌溶液30分钟，并通过经布氏漏斗过滤分离出固体。用冷水、己烷洗涤固体，并将其溶解于甲醇:二氯甲烷(50:50，25mL)中，且在减压下浓缩。将得到的残余物悬浮于冷水(3mL)中，向其中添加Et3N，并用乙酸乙酯萃取2次，每次5mL。用水(5mL)、盐水(5mL)洗涤合并的乙酸乙酯萃取物，用Na2SO4干燥并在减压下浓缩，得到黄色固体状的标题化合物(65mg，67％)。1H NMR(DMSO-d6)δppm:1.18(d,J＝6.12Hz,3H),3.40-3.47(m,1H),3.50-3.56(m,1H),4.20-4.30(m,1H),4.82(t,J＝5.6Hz,1H),5.75(dd,J＝1.88&10.08Hz,1H),6.25(dd,J＝1.92&16.92Hz,1H),6.45(dd,J＝10.08&16.92Hz,1H),7.12(d,J＝8.76Hz,1H),7.29(t,J＝8.08Hz,1H),7.40-7.44(m,3H),7.52(d,J＝8.44Hz,1H),7.91(s,1H),8.12(d,J＝3.64Hz,1H),9.21(s,1H),9.45(s,1H),10.12(s,1H)；LCMS:m/e 458.0(M+1)。
实例249
制备(R)-N-(3-(2-(4-氯-3-(1-羟基丙-2-基氧基)苯基氨基)-5-氟嘧啶-4-基氨基)苯基)丙烯酰胺I-358
根据实例248中所述的方案、步骤和中间物，在步骤1中使用(R)-丙-1,2-二醇代替1，来制备标题化合物。1H NMR(DMSO-d6)δppm:1.18(d,J＝6.12Hz,3H),3.40-3.47(m,1H),3.50-3.56(m,1H),4.20-4.30(m,1H),4.82(t,J＝5.6Hz,1H),5.75(dd,J＝1.88&10.08Hz,1H),6.25(dd,J＝1.92&16.92Hz,1H),6.45(dd,J＝10.08&16.92Hz,1H),7.12(d,J＝8.76Hz,1H),7.29(t,J＝8.08Hz,1H),7.40-7.44(m,3H),7.52(d,J＝8.44Hz,1H),7.91(s,1H),8.12(d,J＝3.64Hz,1H),9.21(s,1H),9.45(s,1H),10.12(s,1H)；LCMS:m/e 458.0(M+1)。
实例250
制备(E)-4-(二甲基氨基)-N-(3-(5-甲基-4-(间甲苯基氨基)嘧啶-2-基氨基)苯基)丁-2-烯酰胺I-360
根据实例3中所述的方案、步骤和中间物，在步骤3中使用(E)-4-(二甲基氨基)丁-2-烯酰氯代替丙烯酰氯，来制备标题化合物。1H NMR(DMSO-d6)δppm:7.91(s,1H),7.85(s,1H),7.52(d,J＝6.4Hz,1H),7.45(d,J＝7.8Hz,1H),7.34(s,1H),7.31-7.26(m,1H),7.21(dd,J＝8.2,8.0Hz,1H),7.01-6.92(m,4H)；6.27(s,1H),6.06(d,J＝15.1Hz,1H),3.14(d,J＝5.5Hz,2H),2.37(s,3H),2.31(s,6H),2.13(s,3H)；LCMS m/z 417(M+1)。
实例251
制备N-(3-(2-(3,4-双(2-甲氧基乙氧基)苯基氨基)-5-氟嘧啶-4-基氨基)苯基)丙烯酰胺I-277
根据下文所述的方案、步骤和中间物制备标题化合物。
A)K2CO3，Cs2CO3，DMF，90℃，16小时；B)HNO3，乙酸，室温，1小时；
C)Pd/C，甲醇，室温，3小时；D)乙酸，乙醇，80℃，16小时；
E)Pd/C，甲醇，室温，16小时；F)丙烯酰氯，K2CO3，NMP，室温，30分钟。
步骤-1
向经搅拌的1(5g，45.4mmol)于DMF(100mL)中的溶液中添加K2CO3(15.6g，112.9mmol)、Cs2CO3(36.6g，112.3mmol)，随后添加2(12.4mL，135.8mmol)，且反应混合物加热到90℃，保持16小时。随后冷却反应混合物，过滤并在减压下浓缩滤液。残余物用乙酸乙酯稀释，用水和盐水洗涤，用无水Na2SO4干燥，过滤并浓缩，得到褐色液体状的3(9.9g，96％)。
步骤-2
在0℃下，向经搅拌的3(2.5g，11mmol)于乙酸(50mL)中的溶液中逐滴添加发烟硝酸(0.83g，13.2mmol)，并在室温下搅拌1小时。将反应混合物倾倒到碎冰上，并通过过滤收集所得固体，且在真空下干燥，得到黄色固体状的4(2.23g，74％)。
步骤-3
在N2氛围下，向4(1g，3.68mmol)于甲醇(20mL)中的溶液中添加Pd/C(0.2g，20％w/w)。随后在H2压力(氢气球)下搅拌反应混合物3小时。反应混合物经硅藻土床过滤，并浓缩滤液，得到褐色油状的5(0.87g，98％)。
步骤-4
向6(0.45g，1.675mmol)于乙醇(4mL)中的溶液中添加5(0.4g，1.658mmol)和乙酸(0.2ml)，并将反应混合物加热到80℃，保持16小时。随后在真空下浓缩反应混合物，并借助管柱色谱法(SiO2，石油醚:乙酸乙酯，6:4)纯化残余物，得到黄色固体状的7(0.13g，17％)。
步骤-5
在N2氛围下向7(0.13g，0.275mmol)于甲醇(3mL)中的溶液中添加Pd/C(26mg,20％w/w)。随后在室温下，在H2压力(氢气球)下搅拌反应混合物16小时。反应混合物经硅藻土床过滤并浓缩滤液，得到绿色固体状的8(0.10g，82％)。
步骤-6
向冷却的8(0.1g，0.225mmol)于NMP(1.0mL)中的溶液中添加K2CO3(0.15g，1.1mmol)、丙烯酰氯(0.002g，0.25mmol)，并在0℃下搅拌反应混合物30分钟。随后，将反应混合物逐滴添加到搅拌的冷10％NaHCO3溶液(约5ml)中，并在0℃下搅拌30分钟。通过经布氏漏斗过滤来分离沉淀析出的固体。将固体溶解于甲醇:二氯甲烷(1:1，25mL)中，并在减压下浓缩。将得到的残余物悬浮于冷水(3mL)中，向其中添加Et3N，并用乙酸乙酯萃取。用水和盐水洗涤合并的乙酸乙酯萃取物，用Na2SO4干燥并在减压下浓缩，得到黄色固体状的I-277(0.049g，44％)。
1H NMR(DMSO-d6):δ＝3.28(s,3H),3.29(s,3H),3.56-3.60(m,4H),3.88(t,J＝4.8Hz,2H),3.98(t,J＝4.9Hz,2H),5.74(d,J＝12.1Hz,1H),6.24(d,J＝14Hz,1H),6.45(dd,J＝16,10Hz,1H),6.75(d,J＝8.7Hz,1H),7.21-727(m,3H),7.41(d,J＝8Hz,1H),7.52(d,J＝8Hz,1H),7.89(s,1H),8.07(d,J＝3.7Hz,1H),8.95(s,1H),9.38(s,1H),10.12(s,1H)；LCMS:m/e:498.2(M+1)。
实例252
制备2-(2-(4-(4-(3-丙烯酰胺基苯基氨基)-5-氟嘧啶-2-基氨基)苯氧基)乙氧基)乙基氨基甲酸叔丁酯I-370
根据实例245中所述的方案、步骤和中间物，在步骤1中使用2-(2-(4-氨基苯氧基)乙氧基)乙基氨基甲酸叔丁酯代替2，来制备标题化合物。1H NMR(DMSO-d6):δ＝1.37(s,9H),3.09(m,2H),3.43(t,J＝6.0Hz,2H),3.68(d,J＝4.3Hz,2H),3.98(t,J＝4.3Hz,2H),5.75(d,J＝11.4Hz,1H),6.25(d,J＝15.6Hz,1H),6.45(dd,J＝16.9,10Hz,1H),6.73-6.81(m,3H),7.27(t,J＝8.1Hz,1H),7.40(d,J＝7.9Hz,1H),7.47-7.53(m,3H),7.92(s,1H),8.06(d,J＝3.6Hz,1H),8.96(s,1H),9.36(s,1H),10.12(s,1H)；LCMS:m/e:553.2(M+1)。
实例253
制备N1-(2-(2-(4-(4-(3-丙烯酰胺基苯基氨基)-5-氟嘧啶-2-基氨基)苯氧基)乙氧基)乙基)-N5-(15-氧代-19-((3aS,4S,6aR)-2-氧代六氢-1H-噻吩并[3,4-d]咪唑-4-基)-4,7,10-三氧杂-14-氮杂十九烷基)戊二酰胺I-363
根据实例204中所述的方案、步骤和中间物，在步骤1中使用2-(2-(4-(4-(3-丙烯酰胺基苯基氨基)-5-氟嘧啶-2-基氨基)苯氧基)乙氧基)乙基氨基甲酸叔丁酯(I-370，如实例252中所述)代替I-45，来制备标题化合物。LC/MS(RT＝2.045/(M+H))995.4。
实例254
制备(R)-N-(3-(5-氟-2-(3-氟-4-(1-羟基丙-2-基氧基)苯基氨基)嘧啶-4-基氨基)苯基)丙烯酰胺I-372
根据实例20中所述的方案、步骤和中间物，在步骤2中使用(R)-2-(4-氨基-2-氟苯氧基)丙-1-醇代替4，来制备标题化合物。1HNMR(DMSO-d6):δ＝1.17(d,J＝6.2Hz,3H),3.40-3.46(m,1H),3.50-3.56(m,1H),4.22(q,J＝5.9Hz,1H),4.83(t,J＝5.8Hz,1H),5.75(dd,J＝10.1,1.9Hz,1H),6.25(dd,J＝16.9,1.9Hz,1H),6.46(dd,J＝16.9,10.1Hz,1H),6.98(t,J＝9.4Hz,1H),7.24-7.31(m,2H),7.42(d,J＝8.2Hz,1H),7.49(d,J＝7.9Hz,1H),7.68(dd,J＝14.3,2.4Hz,1H),7.93(s,1H),8.11(d,J＝3.7Hz,1H),9.20(s,1H),9.45(s,1H),10.14(s,1H)；LCMS:m/e 442.2(M+1)。
实例255
制备(S)-N-(3-(5-氟-2-(3-氟-4-(1-羟基丙-2-基氧基)苯基氨基)嘧啶-4-基氨基)苯基)丙烯酰胺I-373
根据实例20中所述的方案、步骤和中间物，在步骤2中使用(S)-2-(4-氨基-2-氟苯氧基)丙-1-醇代替4，来制备标题化合物。LC/MS(RT＝3.316/(M+H))442.0。
实例256
制备2-氨基-3-甲基丁酸(S)-((R)-2-(4-(4-(3-丙烯酰胺基苯基氨基)-5-氟嘧啶-2-基氨基)-2-氟苯氧基)丙基)酯I-374
根据下文所述的方案、步骤和中间物制备标题化合物。
A)EDC.HCl，HOBT，DMAP，NMM，DMF，室温，16小时；
B)HCl(1M的乙醚溶液)，0℃，1小时。
步骤-1
向经搅拌的I-372(0.08g，0.18mmol)于DMF(0.8mL)中的溶液中添加2(0.057g，0.26mmol)、EDC.HCl(0.086g，0.45mmol)、HOBT(0.06g，0.44mmol)、4-DMAP(0.008)和NMM(0.036g，0.36mmol)。并在室温下搅拌反应混合物16小时。随后用水淬灭反应混合物，并用乙酸乙酯萃取。用水和盐水洗涤乙酸乙酯层，用无水Na2SO4干燥，过滤并浓缩。借助管柱色谱法(SiO2，氯仿:甲醇，9:1)纯化残余物，得到灰白色固体状的3(0.06g，51.7％)。
步骤-2
将冷的HCl的乙醚溶液(1M，6ml)添加到3(60mg，0.09mmol)中，并在0℃下搅拌反应混合物45分钟。随后浓缩反应混合物并用乙醚洗涤得到的固体，且干燥，得到黄色固体状的I-374(其HCl盐形式)(20mg)。1H NMR(DMSO-d6)δ＝0.77(d,J＝6.8Hz,3H),0.83(d,J＝6.8Hz,3H),1.23(d,J＝6.3Hz,3H),1.75-1.83(m,1H),3.10(d,J＝5.2Hz,1H),4.05-4.11(m,1H),4.22(dd,J＝11.7,3.3Hz,1H),4.40-4.50(m,1H),5.73(d,J＝10.2Hz,1H),6.23(d,J＝17.1Hz,1H),6.44(dd,J＝17,10.2Hz,1H),6.98(t,J＝9.2Hz,1H),7.24-7.29(m,2H),7.41(d,J＝7.8Hz,1H),7.48(d,J＝7.8Hz,1H),7.68(d,J＝14.3Hz,1H),7.91(s,1H),8.10(d,J＝3.5Hz,1H),9.23(s,1H),9.44(s,1H),10.13(s,1H)。LCMS:m/e 541.2(M+1)。
实例257
制备2-氨基-3-甲基丁酸(S)-((S)-2-(4-(4-(3-丙烯酰胺基苯基氨基)-5-氟嘧啶-2-基氨基)-2-氟苯氧基)丙基)酯I-377
根据实例256中所述的方案、步骤和中间物，在步骤1中使用(S)-N-(3-(5-氟-2-(3-氟-4-(1-羟基丙-2-基氧基)苯基氨基)嘧啶-4-基氨基)苯基)丙烯酰胺(实例255中所述的I-373)代替I-372，来制备标题化合物。LC/MS(RT＝3.227/(M+H))542.2。
实例258
制备2-氨基-3-甲基丁酸(S)-((S)-2-(5-(4-(3-丙烯酰胺基苯基氨基)-5-氟嘧啶-2-基氨基)-2-氯苯氧基)丙基)酯I-369
根据实例256中所述的方案、步骤和中间物，在步骤1中使用(S)-N-(3-(2-(4-氯-3-(1-羟基丙-2-基氧基)苯基氨基)-5-氟嘧啶-4-基氨基)苯基)丙烯酰胺(实例248中所述的I-357)代替I-372，来制备标题化合物。LC/MS(RT＝3.54/(M+H))557.2。
实例259
制备N-(3-(2-(4-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)苯基氨基)-5-氟嘧啶-4-基氨基)苯基)丙烯酰胺I-371
根据下文所述的方案、步骤和中间物制备标题化合物。
A)K2CO3，DMSO，室温，16小时；B)Pd/C，乙醇，16小时；C)Pd(OAc)2，BINAP，Cs2CO3，甲苯，110℃，16小时；D)甲磺酰氯，Et3N，CH2Cl2，室温，1小时；E)叠氮化钠，DMF，70℃，4小时；F)TFA，CH2Cl2，0℃-室温，1.5小时；G)丙烯酰氯，NMP，K2CO3，30分钟。
步骤-1
向经搅拌的1(1g，7.09mmol)于DMSO(20mL)中的溶液中添加K2CO3(0.96g，6.95mmol)，并在室温下搅拌15分钟。随后添加2(3.7g，34.86mmol)，并在室温下持续搅拌16小时。将反应混合物倾倒到冰水中，并用乙酸乙酯萃取。用水和盐水洗涤有机层，用无水Na2SO4干燥，过滤并浓缩，得到黄色固体状的3(1.0g，62％)。
步骤-2
在N2下，向3(1.0g，4.4mmol)于乙醇中的溶液中添加Pd/C(0.1g，10％w/w)，随后在H2压力(氢气球)下搅拌反应混合物16小时。接着过滤反应混合物并浓缩滤液，得到褐色粘性液体状的4(0.8g，92.2％)。
步骤-3
在N2氛围下，在110℃下加热4(0.3g，1.52mmol)、5(0.61g，1.8mmol)、Pd(OAc)2(0.017g，0.076mmol)、BINAP(0.066g，0.106mmol)和Cs2CO3(1.23g，3.78mmol)于脱气甲苯(20mL)(用N2净化甲苯30分钟)中的混合物16小时。冷却反应混合物，用EtOAc稀释，用水和盐水洗涤并用Na2SO4干燥。过滤，随后在减压下浓缩，得到残余物，借助管柱色谱法(SiO2，石油醚:乙酸乙酯，6:4)进一步纯化残余物，得到褐色固体状的6(0.3g，39.5％)。
步骤-4
0℃下，向经搅拌的6(0.35g，0.7mmol)和三乙胺(0.2mL，1.4mmol)于二氯甲烷(10mL)中的溶液中添加甲磺酰氯(0.12g，1.05mmol)，随后在室温下搅拌反应混合物1小时。用水淬灭反应混合物；分离有机层，用无水Na2SO4干燥并浓缩，得到无色油状的7(0.4g，粗品)。
步骤-5
向经搅拌的7(0.4g，0.69mmol)于DMF(5mL)中的溶液中添加叠氮化钠(0.054g，0.83mmol)，并将反应混合物加热到70℃，保持4小时。随后用冰水处理反应混合物，并用乙酸乙酯萃取。用水和盐水洗涤乙酸乙酯层，用无水Na2SO4干燥，过滤并浓缩，得到的8为粘性油状8(0.3g，82.6％)。
步骤-6
在0℃下，向经搅拌的3(0.3g，0.57mmol)于无水CH2Cl2(10mL)中的溶液中添加CF3COOH(1.0mL)，并在0℃下搅拌反应混合物30分钟，随后在室温下搅拌1小时。在减压下浓缩反应混合物，并用NaHCO3溶液处理残余物且用乙酸乙酯萃取。用水洗涤合并的EtOAc萃取物。随后用10％柠檬酸溶液进行萃取。用10％NaOH溶液使合并的柠檬酸萃取物碱化，随后用EtOAc萃取。用水和盐水洗涤EtOAc萃取物，用Na2SO4干燥并浓缩，得到褐色固体状的9(0.17g，70％)。
步骤-7
在0℃下向经搅拌的9(0.075g，0.177mmol)于NMP(1.5mL)中的溶液中添加K2CO3(0.05g，0.36mmol)，随后添加丙烯酰氯(0.017g，0.188mmol)，且在0℃下搅拌反应混合物30分钟。随后将反应混合物逐滴添加到搅拌的冷10％NaHCO3溶液中。添加完成后，再在0℃下搅拌溶液30分钟，并通过经布氏漏斗过滤来分离分开的固体。用冷水、己烷洗涤固体，并将其溶解于甲醇:二氯甲烷(1:1，5mL)中，随后在减压下浓缩。将得到的残余物悬浮于冷水(3mL)和Et3N(约1ml)中，搅拌一会，并用乙酸乙酯萃取。用水和盐水洗涤合并的乙酸乙酯萃取物，用Na2SO4干燥并在减压下浓缩。借助管柱色谱法(SiO2，石油醚:乙酸乙酯，1:1)纯化得到的残余物2次，得到白色固体状的I-371(0.04g，47.3％)。1H NMR(DMSO-d6):δ＝3.42(t,J＝4.9Hz,1H),3.66(t,J＝4.9Hz,1H),3.72-3.77(m,4H),4.00(t,J＝4.6Hz,2H),5.75(dd,J＝10.1,1.8Hz,1H),6.25(dd,J＝17,1.9Hz,1H),6.45(dd,J＝16.9,10.1Hz,1H),6.75(d,J＝9Hz,2H),7.27(t,J＝8.1Hz,1H),7.40(d,J＝8Hz,1H),7.47-7.53(m,3H),7.92(s,1H),8.06(d,J＝3.7Hz,1H),8.97(s,1H),9.37(s,1H),10.12(s,1H)；LCMS:m/e 479.2(M+1)。
实例260
制备N-(3-(2-(4-(2-叠氮基乙氧基)苯基氨基)-5-氟嘧啶-4-基氨基)苯基)丙烯酰胺I-376
根据实例259中所述的方案、步骤和中间物，在步骤3中使用2-(4-氨基苯氧基)乙醇代替4，来制备标题化合物。LC/MS(RT＝3.447/(M+H))435.2。
实例261
制备N-(3-(2-(4-(2-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)乙氧基)苯基氨基)-5-氟嘧啶-4-基氨基)苯基)丙烯酰胺I-379
根据实例259中所述的方案、步骤和中间物，在步骤1中使用2,2'-(乙烷-1,2-二基双(氧基))二乙醇代替2，来制备标题化合物。LC/MS(RT＝4.454/(M+H))475.6。
实例262
制备(E)-N-(3-(2-(4-氯-3-(2-甲氧基乙氧基)苯基氨基)-5-氟嘧啶-4-基氨基)苯基)丁-2-烯酰胺I-375
根据实例238中所述的方案、步骤和中间物，在步骤4中使用(E)-丁-2-烯酰氯代替7，来制备标题化合物。LC/MS(RT＝4.026/(M+H))473.2。
实例263
制备N-(3-(5-氟-4-(4-(2-甲氧基乙氧基)苯基氨基)嘧啶-2-基氨基)苯基)丙烯酰胺I-381
根据实例4中所述的方案、步骤和中间物，在步骤1中使用4-(2-甲氧基乙氧基)苯胺代替2，来制备标题化合物。LC/MS(RT＝2.275/(M+H))424.1。
实例264
制备N-(3-(5-氟-4-(3-(2-(N-吗啉基)乙氧基)苯基氨基)嘧啶-2-基氨基)苯基)丙烯酰胺I-382
根据实例4中所述的方案、步骤和中间物，在步骤1中使用3-(2-N-吗啉基乙氧基)苯胺代替2，来制备标题化合物。LC/MS(RT＝2.108/(M+H))479.2。
实例265
制备(S)-N-(3-(5-氟-4-(4-(四氢呋喃-3-基氧基)苯基氨基)嘧啶-2-基氨基)苯基)丙烯酰胺I-338
根据实例4中所述的方案、步骤和中间物，在步骤1中使用(S)-4-(四氢呋喃-3-基氧基)苯胺代替2，来制备标题化合物。LC/MS(RT＝1.71/(M+H))458.1。
生物实例
下文描述的分析用于测量所提供的化合物作为BTK、TEC、ITK、BMX、ErbB1(EGFR)、ErbB2、ErbB4和JAK3的抑制剂的生物活性。
实例266
用于评估针对BTK的效力的Omnia分析方案
下文将描述使用EGFR-WT和EGFR-T790M/L858R的方案，且所述方案的BTK优化的试剂条件如下所示。
厂商(英杰公司(Invitrogen)，加利福尼亚州卡尔斯巴德(Carlsbad,CA))在其网页上对分析平台的技术细节进行了最佳阐述，URL如下：www.invitrogen.com/content.cfm？pageid＝11338或
www.invitrogen.com/site/us/en/home/Products-and-Services/Applications/Drug-Discovery/Target-and-Lead-Identification-and-Validation/KinaseBiology/KB-Misc/Biochemical-Assays/Omnia-Kinase-Assays.html。
简言之，在由20mM Tris(pH 7.5)、5mM MgCl2、1mM EGTA、5mMβ-甘油磷酸盐、5％甘油(10X储备液，KB002A)和0.2mM DTT(DS001A)组成的1X激酶反应缓冲液中制备含有EGFR-WT(PV3872；来自英杰公司(Invitrogen))和EGFR-T790M/L858R(40350；来自BPS生物科技公司(BPS Bioscience)，加利福尼亚州圣地亚哥(San Diego,CA))、1.13X ATP(AS001A)和适合的结合Tyr-Sox的肽底物(KCZ1001)的10X储备液。在27℃下，在康宁(Corning)(#3574)384孔白色非结合表面微量滴定板(康宁公司(Corning)，纽约(NY))中，将5μL每一种酶与0.5μL体积的50％DMSO和在50％DMSO中制备的连续稀释化合物一起预培育30分钟。通过添加45μL ATP/Tyr-Sox肽底物混合物起始激酶反应，并在来自拜尔泰克公司(BioTek)(佛蒙特州威努斯基(Winooski,VT))的Synergy4读板器中，在λex360/λem485下每30到90秒进行监测，持续60分钟。在每次分析结束时，检验每一孔的进度曲线的线性反应动力学和适配度统计学(fit statistics)(R2，95％置信区间，绝对平方和)。由相对荧光单位相对于时间(分钟)的图的斜率测定每一反应的初始速度(0分钟到约30分钟)，随后在GraphPad软件公司(加利福尼亚州圣地亚哥(San Diego,CA))的GraphPad Prism中针对抑制剂浓度作图，以便由log[抑制剂]相对于反应、可变斜率模型估算出IC50。
上述方案的经修改的BTK优化的试剂条件为：
[BTK]＝5nM，[ATP]＝40mM，[Y5-Sox]＝10mM(ATP KMapp为约36mM)。
实例267
表6显示在BTK抑制分析中所选本发明化合物的活性。化合物编号对应于表5中的化合物编号。活性指定为“A”的化合物提供的IC50≤10nM；活性指定为“B”的化合物提供的IC50为10-100nM；活性指定为“C”的化合物提供的IC50为100-1000nM；活性指定为“D”的化合物提供的IC50为1000-10,000nM；而活性指定为“E”的化合物提供的IC50≥10,000nM。
表6.BTK抑制数据
实例268
BTK拉莫斯(Ramos)细胞分析
在拉莫斯人类伯基特氏淋巴瘤细胞(Ramos human Burkitt lymphoma cell)中分析化合物I-2、I-4和I-7。使拉莫斯细胞在T225烧瓶中悬浮生长，短暂离心，再悬浮于50ml无血清培养基中，并培育1小时。将化合物添加到无血清培养基中的拉莫斯细胞中，最终浓度达到1、0.1、0.01或0.001μM。将拉莫斯细胞与化合物一起培育1小时，再次洗涤，并再悬浮于100μl无血清培养基中。随后，用1μg山羊F(ab')2抗人类IgM刺激细胞，并在冰上培育10分钟，以活化B细胞受体信号传导路径。10分钟后，用PBS洗涤细胞1次，并随后在冰上用英杰公司的细胞提取缓冲液(Invitrogen Cell Extraction buffer)溶解。将16μg来自溶解产物的总蛋白质装载于凝胶上，并探测印迹中BTK底物PLCγ2的磷酸化。在拉莫斯细胞中对BTK信号传导的剂量反应抑制描绘于图1、2、3、4和5中。
表7显示在BTK拉莫斯细胞抑制分析中所选本发明化合物的活性。化合物编号对应于表5中的化合物编号。活性指定为“A”的化合物提供的IC50≤10nM；活性指定为“B”的化合物提供的IC50为10-100nM；活性指定为“C”的化合物提供的IC50为100-1000nM；活性指定为“D”的化合物提供的IC50为1000-10,000nM；而活性指定为“E”的化合物提供的IC50≥10,000nM。
表7.BTK拉莫斯细胞抑制数据
实例269
利用拉莫斯细胞进行的洗脱实验
在37℃下，在含1％谷氨酰胺的RPMI培养基中对拉莫斯细胞进行血清饥饿处理1小时。在饥饿处理后，用在无血清RPMI培养基中稀释的100nM化合物处理拉莫斯细胞1小时。化合物处理后，去除培养基，并用不含化合物的培养基洗涤细胞。随后，每2小时洗涤拉莫斯细胞，并将其再悬浮于新鲜的无化合物培养基中。在指定时间点时收集细胞，并在冰上用1μg抗人类IgM(南方生物技术公司(Southern Biotech)，目录号2022-01)处理10分钟以诱导BCR信号传导，并随后在PBS中洗涤。接着在补充有数片罗氏(Roche)完全蛋白酶抑制剂片剂(罗氏公司(Roche)11697498001)以及磷酸酶抑制剂(罗氏公司04 906 837 001)的细胞提取缓冲液(英杰公司FNN0011)中溶解拉莫斯细胞，并在各泳道中装载18μg总蛋白质溶解产物。通过利用来自细胞信号传导技术公司(Cell Signaling Technologies)目录号3871的磷酸化特异性抗体进行蛋白质免疫印迹测量BTK激酶底物(PLCγ2)的磷酸化，来分析对BTK激酶活性的抑制。利用化合物I-2、I-4和I-7进行本实验得到的结果描绘于图1、2和3中。
表8提供在拉莫斯洗脱分析中所选化合物的数据。
表8.BTK洗脱数据
实例270
BTK的质谱分析
在相对于蛋白质10倍过量的I-7存在下，培育完整BTK一小时。用10μl 0.1％TFA稀释样品的等分试样(2μl)，接着使用芥子酸(Sinapinic acid)作为解吸附基质(10mg/ml于20:80的0.1％TFA:乙腈中)，用微量C4吸管尖头(micro C4 ZipTipping)直接转移到MALDI目标上。参看图15。上图显示完整BTK蛋白的质谱迹线(m/z 81,032Da)。下图显示当BTK与I-7一起培育时的质谱迹线(mw＝345.4)。质心质量(m/z＝81,403Da)显示约371.1Da的正迁移，表明BTK经I-7完全修饰。完全修饰BTK的其它化合物包括I-96、I-71、I-149、I-161、I-163、I-182、I-195、I-207、I-219和I-244。
实例271
人类原代B细胞增殖分析
使用设计成借助阴性选择来分离CD 19+、IgD+细胞的MACS纯化试剂盒，从100mL全血中纯化出人类原生B细胞。将纯化的原生B细胞再悬浮于RPMI完全培养基中，并用5μg/mlα-IgM刺激72小时。最后16小时时在培养基中纳入3H-胸苷，收集细胞，并测量3H的并入量。B细胞增殖的抑制与α-IgM刺激后BTK底物磷酸化的抑制相关。重要的是，骨架与I-7相同但对BTK无生物化学活性的分子IR-7在原生B细胞增殖分析中不具活性。
表9
化合物编号 EC50(nM)
I-7 1-10
IR-7 >1000
I-190 10-100
I-182 1-10
I-96 1-10
实例272
B细胞淋巴瘤增殖分析
所提供的化合物可抑制各种B细胞淋巴瘤细胞系的增殖，如表10中所示。化合物编号对应于表5中的化合物编号。活性指定为“A”的化合物提供的EC50<0.1μM；活性指定为“B”的化合物提供的EC50为0.1-1μM；活性指定为“C”的化合物提供的EC50为1-10μM；而活性指定为“D”的化合物提供的EC50>10μM。
表10
实例273
活体内非胸腺依赖性(TI-2)B细胞活化
第0天到第5天，每天给予C57/B6小鼠100mg/kg的适当化合物。第1天，用25μg三硝基苯聚蔗糖(TNP-Ficoll)对小鼠进行1次免疫，第6天收集血清，并借助ELISA分析循环α-TNP IgM(1:1600血清稀释度)和IgG3(1:200血清稀释度)抗体产生。结果表示每一处理组中10只小鼠的平均值，且在表11中以非TI-2依赖性B细胞活化的抑制％形式提供。
表11
实例274
胶原蛋白抗体诱发的关节炎模型
第0天，测量基线脚垫，并以使各组之间无显著差异的方式将动物分配到各组中，由此产生各个组。随后，将2mg Arthritomab单克隆抗体混合液经静脉内接种到每一动物体内。此时，开始用测试剂进行处理。第6天，将含50μg LPS的200μl无菌PBS经腹膜内注射到每一动物体内。第6、7、8、9、10、11、12、14、18和21天，进行脚垫测量和临床评分。表12显示结果。
表12
实例275
PG-PS关节炎模型
第0天，对雌性李维斯大鼠(Lewis rat)腹膜内(IP)推注每克大鼠体重15μg量的肽聚糖-多糖(PG-PS)。基线对照大鼠仅IP推注PBS。在即将投予PG-PS之前，对媒剂和处理组通过经口管饲进行给药。每天用媒剂和化合物处理，持续到第22天。在整个研究期间，利用测径器收集两个后肢的最大横向踝宽度测量值。第23天，终止研究，并计算踝肿胀的最终变化，并与媒剂对照组相比较。表13显示两种化合物的结果(n＝实验数量)。
表13
化合物编号 n 踝肿胀抑制％
I-7 1 77.5
I-96 2 82.8
实例276
TEC激酶的质谱分析(化合物I-2)
将TEC激酶(45pmol；英杰公司)与10倍过量的(I-2)(450pmol)一起培育3小时，随后进行胰蛋白酶消化。在化合物培育后，将碘代乙酰胺用作烷化剂。也制备未添加(I-2)的对照样品(45pmol)。对于胰蛋白酶消化产物，用15μl 0.1％TFA稀释5μl等分试样(7.5pmol)，随后使用α氰基-4-羟基肉桂酸作为基质(5mg/ml于50:50的0.1％TFA:乙腈中)，用微量C18吸管尖头直接转移到MALDI目标上。
如图6中所示，预期的待修饰的肽(GCLLNFLR)在与I-2(MI质量为359.17Da)反应后在MH+1294.72处立即显现出来。在MH+992.56处，对照样品中经碘代乙酰胺修饰的肽也相当明显。有趣的是，在与化合物I-2反应的消化产物中，经碘代乙酰胺修饰的肽不明显，表明此反应是完全的。不存在其它经修饰的肽的迹象。
在质谱的低质量范围中，于MH+360.17处观察到化合物I-2的迹象。所述360.17峰的片段化质谱确实显示出在经修饰肽的PSD质谱中1294.72处显而易见的诊断片段(参看图6)。
为了进一步验证经修饰肽的存在，对经碘代乙酰胺标记(992.56)和经I-2标记(1294.72)的肽进行PSD(MS/MS)分析。在使用Mascot MS/MS离子搜索程序(Mascot MS/MSIon Search program)对NCBI nr智人数据库进行数据库搜索后，发现在两种情况下，最佳匹配都为预期的肽。
仪器：
对于胰蛋白酶消化产物，仪器设置成反射模式，且脉冲提取设置(pulsedextraction setting)为2200。使用Laser Biolabs Pep Mix标准品(1046.54、1296.69、1672.92、2093.09、2465.20)进行校准。对于CID/PSD分析，使用光标选择肽以设置离子门控定时和在约20％以上的激光功率下发生的片段化，且使用氦气作为CID的碰撞气体。片段的校准是使用曲线场反射(Curved field Reflectron)的P14R片段校准来进行。
实例277
TEC激酶的质谱分析(化合物I-4)
将TEC激酶(45pmol；英杰公司)与10倍过量的(I-4)(450pmol)一起培育3小时，随后进行胰蛋白酶消化。在化合物培育后，将碘代乙酰胺用作烷化剂。也制备未添加(I-4)的对照样品(45pmol)。对于胰蛋白酶消化产物，用15μl 0.1％TFA稀释5μl等分试样(7.5pmol)，随后使用α氰基-4-羟基肉桂酸作为基质(5mg/ml于50:50的0.1％TFA:乙腈中)，用微量C18吸管尖头直接转移到MALDI目标上。
如图7中所示，预期的待修饰的肽(GCLLNFLR)在MH+1355.72处立即显现出来。这是当加合物质量为420.21的化合物I-4添加到935.51的肽质量中时所预期的质量。在MH+992.56处，对照样品中经碘代乙酰胺修饰的肽也相当明显。有趣的是，在与化合物I-4反应的消化产物中，经碘代乙酰胺修饰的肽不明显，表明此反应是完全的。不存在其它经修饰的肽的迹象。
在质谱的低质量范围中，于MH+421.35处观察到化合物I-4的迹象。所述421.35峰的片段化质谱确实揭露出在经修饰肽的PSD质谱中1355.72处显而易见的两个显著的峰(参看图7)。
为了进一步验证经化合物I-4修饰的肽的存在，对在MH+1355.72处的肽进行PSD(MS/MS)分析。由于片段的强度较低，以致不可能关联数据库。然而，来自I-4分子本身的诊断片段足以进行鉴别。位于MH+376.38和421.83处的诊断片段来自I-4。
仪器：
对于胰蛋白酶消化产物，仪器设置成反射模式，且脉冲提取设置为1800。使用Laser Biolabs Pep Mix标准品(1046.54、1296.69、1672.92、2093.09、2465.20)进行校准。对于CID/PSD分析，使用光标选择肽以设置离子门控定时和在约20％以上的激光功率下发生的片段化，且使用氦气作为CID的碰撞气体。片段的校准是使用曲线场反射的P14R片段校准来进行。
实例278
TEC激酶的质谱分析(化合物I-7)
将TEC激酶(45pmol；英杰公司)与10倍过量的(I-7)(450pmol)一起培育3小时，随后进行胰蛋白酶消化。在化合物培育后，将碘代乙酰胺用作烷化剂。也制备未添加(I-7)的对照样品(45pmol)。对于胰蛋白酶消化产物，用15μl 0.1％TFA稀释5μl等分试样(7.5pmol)，随后使用α氰基-4-羟基肉桂酸作为基质(5mg/ml于50:50的0.1％TFA:乙腈中)，用微量C18吸管尖头直接转移到MALDI目标上。
如图8中所示，预期的待修饰的肽(GCLLNFLR)在MH+1280.73处立即显现出来。这是当加合物质量为345.16的化合物I-7添加到935.51的肽质量中时所预期的质量。在MH+992.56处，对照样品中经碘代乙酰胺修饰的肽也相当明显。有趣的是，在与化合物I-7反应的消化产物中，经碘代乙酰胺修饰的肽不明显，表明此反应是完全的。在MH+1985.93(TIDELVECEETFGR)处，无任何其它经修饰肽的迹象。
在质谱的低质量范围中，于MH+346.32处观察到化合物I-7的迹象。所述346.32峰的片段化质谱确实显示出在两种经修饰肽的PSD质谱中显而易见的许多诊断片段(参看图8)。
为了进一步验证经化合物I-7修饰的肽的存在，对在MH+1280.73和1985.93处的肽进行PSD(MS/MS)分析。利用智人数据库进行的关联性分析鉴别出经I-7修饰的正确的肽。
仪器：
对于胰蛋白酶消化产物，仪器设置成反射模式，且脉冲提取设置为2200。使用Laser Biolabs Pep Mix标准品(1046.54、1296.69、1672.92、2093.09、2465.20)进行校准。对于CID/PSD分析，使用光标选择肽以设置离子门控定时和在约20％以上的激光功率下发生的片段化，且使用氦气作为CID的碰撞气体。片段的校准是使用曲线场反射的P14R片段校准来进行。
实例279
用于评估针对ITK激酶的活性形式的效力的Omnia分析方案
本实例将描述用于测量化合物针对ITK酶的活性形式的固有效力的连续读数激酶分析(continuous-read kinase)，这一分析如上文实例251中所述，但经修饰ITK优化的试剂条件如下：
[ITK]＝10nM，[ATP]＝25μM，[Y6-Sox]＝10μM(ATP KMapp＝33μM)。
实例280
表14显示在ITK抑制分析中所选本发明化合物的活性。化合物编号对应于表5中的化合物编号。活性指定为“A”的化合物提供的IC50≤10nM；活性指定为“B”的化合物提供的IC50为10-100nM；活性指定为“C”的化合物提供的IC50为100-1000nM；活性指定为“D”的化合物提供的IC50为1000-10,000nM；而活性指定为“E”的化合物提供的IC50≥10,000nM。
表14.ITK抑制数据
实例281
用于评估针对BMX激酶的活性形式的效力的Omnia分析方案
本实例将描述用于测量化合物针对BMX酶的活性形式的固有效力的连续读数激酶分析，这一分析如上文实例251中所述，但经修饰BMX优化的试剂条件如下：
[BMX]＝2.5nM，[ATP]＝100μM，[Y5-Sox]＝7.5μM(ATP KMapp＝107μM)。
实例282
表15显示在BMX抑制分析中所选本发明化合物的活性。化合物编号对应于表5中的化合物编号。活性指定为“A”的化合物提供的IC50≤10nM；活性指定为“B”的化合物提供的IC50为10-100nM；活性指定为“C”的化合物提供的IC50为100-1000nM；活性指定为“D”的化合物提供的IC50为1000-10,000nM；而活性指定为“E”的化合物提供的IC50≥10,000nM。
表15.BMX抑制数据
实例283
使用杆状病毒和昆虫细胞进行的EGFR-WT和EGFR C797S突变体的克隆、表达和纯 化
(i)EGFR-WT和突变型激酶域的亚克隆
将EGFR-WT激酶域(NM_005228，NP_005219.2)的氨基酸696到1022亚克隆到pFastHTa载体(英杰公司，加利福尼亚州卡尔斯巴德)的NcoI和HindIII位点中。为了制造EGFR突变型蛋白质，根据制造商的说明，使用斯特塔基因公司(Stratagene)的QuikChange定点突变试剂盒(斯特塔基因公司，德克萨斯州锡达河(Cedar Creek,TX))将797位的半胱氨酸变为丝氨酸。
(ii)表达
根据蓝天生物技术公司的悬浮转染方案(Blue Sky Biotech's suspensiontransfection protocol；马萨诸塞州伍斯特(Worcester,MA))，在SF9细胞中产生P1杆状病毒储备液。在125ml SF21昆虫细胞(在补充有10mg/L庆大霉素(gentamicin)(英杰公司，加利福尼亚州卡尔斯巴德，目录号15710-064)的SF900I SFM(英杰公司，目录号10902-088)中生长)的培养物中，使用每100ml细胞悬浮液0.1ml病毒的病毒负载量进行表达分析。使用蓝天生物技术公司的感染动力学监测系统(Blue Sky Biotech's Infection KineticsMonitoring system；马萨诸塞州伍斯特)对表达进行优化。
(iii)纯化
使受感染的昆虫细胞聚结成团。将细胞聚结块以每克湿细胞糊10ml的比率再悬浮于蓝天生物技术公司的溶解缓冲液(马萨诸塞州伍斯特，1X WX；溶解缓冲液，含有亮肽素(leupeptin)、抑胃肽(pepstatin)、PMSF、抑肽酶(aprotinin)和EDTA的蛋白酶抑制剂混合液)中。通过声波处理使细胞溶解，并通过利用GSA转子以9,000RPM离心30分钟来使溶解产物变澄清。将500μl柱床体积的NiNTA树脂(凯杰公司(Qiagen)，加利福尼亚州巴伦西亚(Valencia,CA))添加到上清液中，并在恒定搅动下，使批料结合2小时。在重力作用下将材料转移到一个空的2ml管柱中。用2ml洗涤缓冲液(蓝天生物科技公司，马萨诸塞州伍斯特，1X WX，25mM咪唑)洗涤管柱。用1X WX+各种浓度的咪唑洗脱蛋白质：洗脱1：75mM咪唑(2个部分，1个柱体积)；洗脱2：150mM咪唑(2个部分，1个柱体积)；洗脱3：300mM咪唑(2个部分，1个柱体积)。借助SDS page随后进行考马斯染色(Coomassie staining)，以及使用抗五组氨酸抗体(凯杰公司，加利福尼亚州巴伦西亚)进行的蛋白质免疫印迹，来分析所有洗脱部分。遵循制造商的说明，使用AcTEV蛋白酶试剂盒(英杰公司，加利福尼亚州卡尔斯巴德，目录号12575-015)，从一些经纯化的蛋白质中去除羧基末端的六组氨酸“标签”。如上文所述，借助SDS page随后进行考马斯染色以及蛋白质免疫印迹对所有样品(Tev切割之前和之后)进行分析。
实例284
EGFR的质谱分析
将野生型EGFR和EGFR(C797S突变)与10倍过量的测试化合物一起培育1小时和3小时。用10μl 0.1％TFA稀释样品的1μl等分试样(总体积5-8μl)，接着使用芥子酸作为解吸附基质(10mg/ml于50:50的0.1％TFA:乙腈中)，用微量C4吸管尖头直接转移到MALDI目标上。完整质量测量值揭露，野生型的标称质量为约37557，而突变型略低，为37500。只观察到野生型EGFR的反应性，其在与经质量为410Da的测试化合物的单一位点共价修饰一致的质量处出现一个新峰。
实例285
用于评估针对EGFR(WT)和EGFR(T790M/L858R)活性酶的效力的Omnia分析方案
如上文实例251中所述进行用于评估针对EGFR的效力的Omnia分析方案，但经EGFR-WT和经EGFR T790M/L858R修饰的优化的试剂条件为：
[EGFR-WT]＝5nM，[ATP]＝15mM，[Y12-Sox]＝5mM(ATP KMapp为约12mM)；和[EGFR-T790M/L858R]＝3nM，[ATP]＝50mM，[Y12-Sox]＝5mM(ATP KMapp为约45mM)。
实例286
表16和17显示在EGFR抑制分析中所选本发明化合物的活性。表16显示野生型EGFR的数据；表17显示两种EGFR突变体的数据。化合物编号对应于表5中的化合物编号。活性指定为“A”的化合物提供的IC50≤10nM；活性指定为“B”的化合物提供的IC50为10-100nM；活性指定为“C”的化合物提供的IC50为100-1000nM；活性指定为“D”的化合物提供的IC50为1000-10,000nM；而活性指定为“E”的化合物提供的IC50≥10,000nM。
表16.EGFR野生型抑制数据
表17.EGFR突变体(T790M/L858R和T790M)的抑制数据
化合物编号 EGFR(T790M/L858R) EGFR(T790M)
I-1 A -
I-2 A A
I-3 A A
I-4 A A
I-5 A -
I-7 A -
I-8 A -
I-9 B -
I-10 B -
I-11 A -
I-23 B -
I-35 A -
I-38 A -
I-39 C -
I-56 A B
IR-7 D -
I-96 A A
实例287
EGFR活性的细胞分析
在A431人类表皮样癌细胞中，使用实质上类似于弗莱(Fry)等人,美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)第95卷,第12022-12027页,1998中所述的方法，分析化合物。具体地说，使A431人类表皮样癌细胞在6孔板中生长到90％汇合，随后在无血清培养基中培育18小时。用1μM指定化合物处理数组细胞2、5、10、30或60分钟，每组细胞有一组副本。用温的无血清培养基从细胞洗掉化合物，培育2小时，再次洗涤，再培育2小时，再次洗涤，随后再培育2小时，再次洗涤并再次培育2小时，随后用100ng/ml EGF刺激5分钟。如弗莱等人所述制备提取物。
在A431人类表皮样癌细胞中，使用实质上类似于弗莱等人中所述的方法分析化合物。具体地说，使A431人类表皮样癌细胞在6孔板中生长到90％汇合，随后在无血清培养基中培育18小时。接着用10、1、0.1、0.01或0.001μM测试化合物处理细胞1小时。接着用100ng/ml EGF刺激细胞5分钟，并如弗莱等人所述制备提取物。将20μg来自溶解产物的总蛋白质装载到凝胶上，并探测印迹中的EGFR磷酸化或p42/p44Erk磷酸化。
实例288
EGFR活性的洗脱实验
使A431人类表皮样癌细胞在6孔板中生长到'90％汇合，随后在无血清培养基中培育18小时。用1μM指定化合物处理数组细胞1小时，每组细胞有一组副本。随后用100ng/mlEGF刺激一组细胞5分钟，并如所述制备提取物。用温的无化合物培养基从另一组细胞洗掉化合物I-7，培育2小时，再次洗涤，再培育2小时，再次洗涤，随后再培育2小时，再次洗涤并再次培育2小时，随后用EGF刺激。利用化合物I-7进行的本实验的结果描绘于图10中。
实例289
在含有EGFR缺失突变型HCC827的HCC827细胞中进行的洗脱实验
将细胞(ATCC，弗吉尼亚州马纳萨斯(Manassas,VA))以每孔2.5×105个细胞的密度涂铺于6孔组织培养板中补充有10％FBS、10μM HEPES、2mM 1-谷氨酰胺、1mM丙酮酸钠和青霉素/链霉素(pen/strep；英杰公司，加利福尼亚州卡尔斯巴德)的生长培养基(RPMI1640)中。24小时后，用PBS洗涤细胞2次，随后在基础培养基(不含FBS的生长培养基)中进行血清饥饿处理过夜。
次日早晨，去除培养基，并将2ml含有1μM化合物的0.1％DMSO溶液的新鲜基础培养基添加到副本孔中。1小时时，用100ng/ml EGF处理1个细胞孔5分钟，用PBS冲洗，随后通过刮入75μl细胞提取缓冲液(英杰公司，加利福尼亚州卡尔斯巴德)加PhosSTOP磷酸酶抑制剂和完全蛋白酶抑制剂(罗氏公司，印第安纳州印第安纳波利斯(Indianapolis,IN))中进行溶解，作为0时间点。去除第二组孔中的化合物，并用基础培养基洗涤2次。每2小时用基础培养基洗涤细胞，持续8小时，第8小时用EGF处理各孔，并如0小时时间点时一般进行溶解。
借助BCA分析(皮尔斯公司(Pierce)，伊利诺伊州罗克福德(Rockford,IL))测定溶解产物的蛋白质浓度，并借助4-12％梯度SDS-PAGE(英杰公司)分离10μg各溶解产物，转移到Immobilon-FL膜(密理博公司(Millipore))上，并用兔抗磷酸化EGFR(Tyr1068)(泽姆德公司(Zymed)，现为英杰公司)和小鼠抗EGFR(细胞信号传导技术公司(Cell SignalingTechnologies)，马萨诸塞州丹弗斯(Danvers,MA))抗体进行探测。使用Odyssey红外成像系统(Odyssey Infrared Imagning；利克尔生物科技公司(Li-Cor Biosciences)；内布拉斯加州林肯(Lincoln,Nebraska))定量磷酸化蛋白质的信号。本实验的结果描绘于图9中，其中此图显示了在相同的“洗脱”实验中化合物I-2与化合物I-4和化合物I-7的结果的比较。
实例290
ERBB4的质谱分析
将Erbb4激酶域(奥普斯特公司(Upstate))与相对于蛋白质10倍过量的化合物I-4和I-11一起培育60分钟。用10μl 0.1％TFA稀释样品的1μl等分试样(总体积4.24μl)，接着使用芥子酸作为解吸附基质(10mg/ml于50:50的0.1％TFA:乙腈中)，用微量C4吸管尖头直接转移到MALDI目标上。对于完整蛋白质的质量测量，仪器设置成线性模式，针对用于校准仪器的肌红蛋白标准品，使用脉冲提取设置16,952(岛津公司Axima TOF2(Shimadzu AximaTOF2))。
完整的ErbB4蛋白出现在MH+35850，其中相应的芥子酸(基质)加合物出现在约200Da以上。以化学计量并入测试化合物(I-4和I-11)(Mw为约410Da)在约410Da以上产生一个新的质量峰(MH+36260)。这与ErbB4经化合物I-4和I-11共价修饰的情形一致。
实例291
ErbB1、ErbB2和/或ErbB4激酶抑制
以实质上类似于英杰公司(英杰公司，加利福尼亚州卡尔斯巴德法拉第大街1600号(1600Faraday Avenue,Carlsbad,California,CA)；http://www.invitrogen.com/downloads/Z-LYTE_Brochure_1205.pdf)所述的方法，使用Z'-LYTETM生物化学分析程序或类似的生物化学分析，来对作为ErbB1、ErbB2和/或ErbB4中一者或多者的抑制剂的本发明化合物进行分析。Z'-LYTETM生物化学分析使用了一种基于荧光的偶合酶格式，并且是基于磷酸化和非磷酸化的肽对蛋白水解裂解的不同敏感度。使用这种分析，发现化合物I-56可以2,233nM的IC50抑制ERBB1。使用这种分析，发现化合物I-56可以2,165nM的IC50抑制ERBB4(HER4)。
实例292
詹纳斯氏-3激酶(JAK3)的质谱分析
将JAK3激酶(33pmol；英杰公司)与10倍过量的(I-7)(327pmol)一起培育3小时，随后进行胰蛋白酶消化。在化合物培育后，使用碘代乙酰胺作为烷化剂。对于胰蛋白酶消化产物，用15μl 0.1％TFA稀释5μl等分试样(5.5pmol)，随后使用α氰基-4-羟基肉桂酸作为基质(5mg/ml于50:50的0.1％TFA:乙腈中)，用微量C18吸管尖头直接转移到MALDI目标上。
如图11中所示，预期的待修饰的肽(LVMEYLPSGCLR)在MH+1725.88处立即显现为最大的峰。这是当加合物质量为345.16的化合物I-7添加到1380.70的肽质量中时所预期的质量。有趣的是，在与化合物I-7反应的消化产物中，经碘代乙酰胺修饰的肽在MH+1437.73处并不明显，表明此反应并未完全完成。这也是存在许多其它经修饰肽的证据，但其信号较低。
在质谱的低质量范围中，于MH+346.12处观察到化合物I-7的迹象。所述346.12峰的片段化质谱没有显示出在经修饰肽的PSD质谱中显而易见的诊断片段(参看图11)。
为了进一步验证经化合物I-7修饰的肽的存在，对在MH+1725.88和1118.55处的肽进行PSD(MS/MS)分析。利用智人数据库进行的关联性分析鉴别出经I-7修饰的正确的肽。也使用相同程序测试化合物I-11，并且显示可测量的修饰。
仪器：
对于胰蛋白酶消化产物，仪器设置成反射模式，且脉冲提取设置为2200。使用Laser Biolabs Pep Mix标准品(1046.54、1296.69、1672.92、2093.09、2465.20)进行校准。对于CID/PSD分析，使用光标选择肽以设置离子门控定时和在约20％以上的激光功率下发生的片段化，且使用氦气作为CID的碰撞气体。片段的校准是使用曲线场反射的P14R片段校准来进行。
实例293
用于评估针对JAK3的活性形式的效力的Omnia分析方案：
以实质上类似于上文实例251中所述的方式进行有关评估针对JAK3的效力的Omnia分析方案，但经修饰JAK3优化的试剂条件为：
[JAK3]＝5nM，[ATP]＝5μM，[Y12-Sox]＝5μM(ATP KMapp为约5μM)。
实例294
表18显示在JAK3抑制分析中所选本发明化合物的活性。化合物编号对应于表5中的化合物编号。活性指定为“A”的化合物提供的IC50≤10nM；活性指定为“B”的化合物提供的IC50为10-100nM；活性指定为“C”的化合物提供的IC50为100-1000nM；活性指定为“D”的化合物提供的IC50为1000-10,000nM；而活性指定为“E”的化合物提供的IC50≥10,000nM。
表18.JAK3抑制数据
实例295
在CTLL2细胞中进行的JAK3细胞分析方案
按下述方案测试化合物I-2、I-4和I-7。CTLL2：鼠类淋巴瘤细胞系ATCC：TIB-214。在RPMI-1640培养基中对每份样品的5×l06个细胞进行IL-2饥饿处理2小时。随后用化合物处理指定样品90分钟。接着用100nM IL-2刺激除DMSO对照样品外的样品10分钟。将样品溶解，并对其进行蛋白质免疫印迹分析。结果显示于图12、图13和图14中。
实例296
在拉莫斯细胞中使用抗生蛋白链菌素珠粒进行的I-7和I-215对BTK的占用率研究
在37℃下，在无血清培养基中将拉莫斯细胞与0.1、0.05、0.01或0.001μM I-7一起培育1小时。通过离心使细胞聚结成团，并在冰上以细胞提取缓冲液(英杰公司)溶解10分钟，离心(在14,000rpm下10分钟)，并收集上清液。在室温下将细胞溶解产物与1μM I-215一起培育1小时，随后在4℃下与偶合抗生蛋白链菌素的琼脂糖珠粒(赛默菲舍尔公司(ThermoFisher))一起培育过夜。用溶解缓冲液洗涤珠粒3次，并在95℃下，在4×LDS样品缓冲液中煮出珠粒中的所结合蛋白质，持续5分钟。借助BTK蛋白质免疫印迹评估与探针I-215缔合的BTK的量。所有值都关于设置为100％的经DMSO处理的样品进行校正。图16显示蛋白质免疫印迹；图17显示图16的定量，说明当将细胞暴露于低浓度(10nM、1nM)的I-7时，未被占用的BTK蛋白可被探针I-215利用；但在较高浓度的I-7下，BTK蛋白被完全占用，并且无法与I-215相互作用。
实例297
利用I-7和探针化合物I-215进行的洗脱实验
在37℃下，在无血清培养基中将拉莫斯细胞与0.1μM I-7或可逆BTK抑制剂对照化合物一起培育1小时。随后在无化合物培养基中洗涤细胞，并在去除化合物后溶解0、4、6或8小时。在室温下将细胞溶解产物与1μM I-215一起培育1小时，随后在4℃下与偶合抗生蛋白链菌素的琼脂糖珠粒一起培育过夜。煮出珠粒中的蛋白质，并借助蛋白质免疫印迹评估BTK的缔合。图18显示蛋白质免疫印迹；图19显示图18的定量，并说明在8小时内所有的BTK蛋白都保持被I-7占用。这表明在拉莫斯细胞中可检测的BTK蛋白的再合成的期限超过8小时。相比之下，利用可逆的抑制剂对照物，有45％的BTK蛋白未结合，并且在0小时可被探针利用，且到4小时时，100％的BTK蛋白未结合，并且能结合探针。所有样品都关于在0小时时收集的经DMSO处理的细胞进行校正。
实例298
借助ELISA测量活体外样品的BTK占用率
为了测定细胞或组织溶解产物中自由BTK的量，使用ELISA方案，其利用一种只结合于自由的未占用BTK的生物素化探针化合物。将经结合的生物素捕捉到涂有抗生蛋白链菌素的ELISA板上，并用小鼠抗BTK抗体(贝克顿迪克逊公司(Becton Dickinson)，美国新泽西州富兰克林拉克斯(Franklin Lakes,NJ,USA))和二次山羊抗小鼠HRP抗体(泽姆德公司(Zymed)，美国加利福尼亚州圣弗朗西斯科(South San Francisco,CA,USA))进行检测。
利用等浓度的拜尔瑞德公司(Biorad)溶解缓冲液(美国加利福尼亚州埃库莱斯(Hercules,CA,USA))、含0.5％牛血清白蛋白和0.05％Tween-20的PBS制备所有样品，达到1μM I-215的最终浓度。在室温下，于混合板中振荡培育样品1小时，以使探针化合物I-215结合于自由的BTK。与I-215一起培育后，将样品添加到经过洗涤的涂有抗生蛋白链菌素的ELISA板(皮尔斯公司，美国伊利诺伊州罗克福德)上，并在室温下振荡培育1小时。随后使用自动洗板机，用含有0.05％Tween-20的PBS洗涤板。在含0.5％BSA的PBS(含0.05％Tween-20)中以1:1000的稀释度制备抗BTK抗体，并添加到ELISA板中。在室温下，振荡培育板1小时。如上文所述，洗涤板，并在含0.5％BSA的PBS(含0.05％Tween-20)中以1:5000的稀释度制备二次HRP抗体。培育板，并如上文所述进行洗涤。将TMB添加到板中，并监测OD650，直到达到1个OD单位。随后通过添加H2SO4使反应终止。使用Gen 5软件对板进行分析，并使用4参数逻辑斯蒂曲线(4Parameter Logistic curve)定量样品。对于标准曲线，使用重组BTK(英杰公司，美国加利福尼亚州卡尔斯巴德)。
表19显示以使>50％或>90％的BTK被占用的浓度报导的拉莫斯细胞的结果。指定为“A”的浓度大于1nM；指定为“B”的浓度大于10nM；且指定为“C”的浓度大于50nM。
表19
化合物编号 >50％占用率 >90％占用率
I-7 A B
I-182 A C
I-96 A B
实例299
在活体外人类原代B细胞共价探针的占用率
如实例256中所述分离出人类原代B细胞，随后将其再悬浮于RPMI培养基(含10％血清)中。将待分析的化合物以1:1000稀释度添加到培养基中。在37℃下，在组织培养恒温箱中将细胞与化合物一起培育1小时。培育后，使细胞聚结成团，用1×PBS洗涤，并在偶而搅动下，于冰上溶解45分钟。在经冷却的微型离心机中以14,000rpm离心样品30分钟，并分离上清液。如实例283中所述，使用I-215分析上清液。I-96和I-182在大于10nM的浓度下占用了至少50％的BTK。
实例300
在活体外狗原代B细胞共价探针的占用率
利用1×PBS将犬类全血(30mL)稀释到总计50mL，并在Histopaque-1077(西格玛阿尔德里奇公司(Sigma Aldrich))的顶部进行分层。在无制动器的贝克曼离心机(Beckmancentrifuge)中以400x g离心全血-Histopaque 30分钟。收集周围血液单核细胞(PBMC)并以400x g持续15分钟使其聚结成团。利用2.5mL RBC溶解缓冲液(波斯顿生物制品公司(Boston Bioproducts))溶解红细胞(RBC)，并在1×PBS中以250x g洗涤剩余的PBMC3次。在37℃下，利用化合物以1:1000稀释度处理PBMC 1小时，用PBS洗涤，并在冰上溶解45分钟。以14,000x g离心溶解产物30分钟，并收集上清液。如实例283中所述，使用I-215对上清液进行分析。I-96在大于10nM的浓度下占用了至少50％的BTK。
实例301
借助ELISA测量活体内样品的BTK占用率
经口给予大鼠30mg/kg化合物，并在化合物处理后2小时或24小时收集脾。在覆有毛玻璃的两个显微镜载玻片之间破坏大鼠的脾，以回收单细胞悬浮液。通过在室温下与RBC溶解缓冲液(波斯顿生物制品公司)一起培育2分钟来溶解红细胞，随后将这些细胞再悬浮于RPMI完全培养基中，并借助离心使其聚结成团。通过用B220+抗体-磁性珠粒结合物进行阳性选择来分离大鼠B细胞，借助MACS柱进行纯化，并以106个细胞/100μl的浓度于拜尔瑞德溶解缓冲液中进行溶解。如实例278中所详细描述，在ELISA方案中使用生物素化的探针化合物I-215对溶解产物进行分析。表20显示结果。
表20
实例302
蛋白质组学分析(Proteomics analysis)
使用质谱分析来鉴别细胞溶解产物中共价结合于I-215的蛋白质。在室温下，将细胞溶解产物与1μM I-215一起培育1小时，随后添加偶合抗生蛋白链菌素的琼脂糖珠粒。使用质谱分析来鉴别除BTK外的蛋白质。其为潜在的“非目标”相互作用。
尽管本文中描述了本发明的多个实施例，但显而易见的是，可以改变基础实例以提供利用本发明的化合物和方法的其它实施例。因此，应了解，本发明的范围将由所附权利要求书而非已用实例方式提供的特定实施例界定。

Claims (10)

1.一种式I-b化合物在制备用于治疗BTK介导的病症的药物中的用途，其中所述BTK介导的病症选自结肠直肠癌或胰腺癌，且所述式I-b化合物具有如下结构：
或其医药学上可接受的盐，其中：
环A是苯基；
环B是苯基；
R1是弹头基团，其中R1在一位置处连接环A，所述位置不是相邻于连接W1的原子的原子；
Ry是卤素、-CN、-CF3、C1-4脂肪族基、C1-4卤代脂肪族基、-OR、-C(O)R或-C(O)N(R)2；
各R基团独立地为氢或任选经取代的选自以下的基团：C1-6脂肪族基、苯基、具有1到2个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的4元到7元杂环、或具有1到4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的5元到6元单环杂芳基环；
W1和W2各为-NR2-；
R2是氢、任选经取代的C1-6脂肪族基或–C(O)R；
m和p独立地为0到4；且
Rx在各情况下独立地选自-R、-OR、-O(CH2)qOR或卤素，其中q为1到4；以及
Rv在各情况下独立地选自-R、卤素、-OR、-O(CH2)qOR、–CN、–NO2、-SO2R、-SO2N(R)2、-SOR、-C(O)R、-CO2R、–C(O)N(R)2、-NRC(O)R、-NRC(O)N(R)2、-NRSO2R或-N(R)2，其中q为1到4。
2.根据权利要求1所述的用途，其中Ry是氟、溴或碘。
3.根据权利要求1所述的用途，其中Ry是-CN、-CF3、C1-4脂肪族基、C1-4卤代脂肪族基、-OR、-C(O)R或-C(O)N(R)2。
4.一种式I-b化合物在制备用于治疗BTK介导的病症的药物中的用途，其中所述BTK介导的病症选自结肠直肠癌或胰腺癌，且所述式I-b化合物具有如下结构：
或其医药学上可接受的盐，其中：
环A是苯基；
环B是任选经取代的选自以下的基团：3元到7元饱和或部分不饱和碳环；8元到10元双环饱和或部分不饱和芳基环；具有1到4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的5元到6元单环杂芳基环；具有1到3个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的4元到7元饱和或部分不饱和杂环；具有1到5个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的7元到10元双环饱和或部分不饱和杂环；或具有1到5个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的8元到10元双环杂芳基环；
R1是弹头基团，其中R1在一位置处连接环A，所述位置不是相邻于连接W1的原子的原子；
Ry是卤素、-CN、-CF3、C1-4脂肪族基、C1-4卤代脂肪族基、-OR、-C(O)R或-C(O)N(R)2；
各R基团独立地为氢或任选经取代的选自以下的基团：C1-6脂肪族基、苯基、具有1到2个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的4元到7元杂环、或具有1到4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的5元到6元单环杂芳基环；
W1和W2各为-NR2-；
R2是氢、任选经取代的C1-6脂肪族基或–C(O)R；
m和p独立地为0到4；且
Rx在各情况下独立地选自-R、-OR、-O(CH2)qOR或卤素，其中q为1到4；以及
Rv在各情况下独立地选自-R、卤素、-OR、-O(CH2)qOR、–CN、–NO2、-SO2R、-SO2N(R)2、-SOR、-C(O)R、-CO2R、–C(O)N(R)2、-NRC(O)R、-NRC(O)N(R)2、-NRSO2R或-N(R)2，其中q为1到4。
5.一种式I-b化合物在制备用于治疗BTK介导的病症的药物中的用途，其中所述BTK介导的病症选自结肠直肠癌或胰腺癌，且所述式I-b化合物具有如下结构：
或其医药学上可接受的盐，其中：
环A是任选经取代的选自以下的基团：3元到7元饱和或部分不饱和碳环；8元到10元双环饱和或部分不饱和芳基环；具有1到4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的5元到6元单环杂芳基环；具有1到3个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的4元到7元饱和或部分不饱和杂环；具有1到5个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的7元到10元双环饱和或部分不饱和杂环；或具有1到5个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的8元到10元双环杂芳基环；
环B是苯基；
R1是弹头基团，其中R1在一位置处连接环A，所述位置不是相邻于连接W1的原子的原子；
Ry是卤素、-CN、-CF3、C1-4脂肪族基、C1-4卤代脂肪族基、-OR、-C(O)R或-C(O)N(R)2；
各R基团独立地为氢或任选经取代的选自以下的基团：C1-6脂肪族基、苯基、具有1到2个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的4元到7元杂环、或具有1到4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的5元到6元单环杂芳基环；
W1和W2各为-NR2-；
R2是氢、任选经取代的C1-6脂肪族基或–C(O)R；
m和p独立地为0到4；且
Rx在各情况下独立地选自-R、-OR、-O(CH2)qOR或卤素，其中q为1到4；以及
Rv在各情况下独立地选自-R、卤素、-OR、-O(CH2)qOR、–CN、–NO2、-SO2R、-SO2N(R)2、-SOR、-C(O)R、-CO2R、–C(O)N(R)2、-NRC(O)R、-NRC(O)N(R)2、-NRSO2R或-N(R)2，其中q为1到4。
6.一种式I-b化合物在制备用于治疗BTK介导的病症的药物中的用途，其中所述BTK介导的病症选自结肠直肠癌或胰腺癌，且所述式I-b化合物具有如下结构：
或其医药学上可接受的盐，其中：
环A是任选经取代的选自以下的基团：3元到7元饱和或部分不饱和碳环；8元到10元双环饱和或部分不饱和芳基环；具有1到4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的5元到6元单环杂芳基环；具有1到3个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的4元到7元饱和或部分不饱和杂环；具有1到5个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的7元到10元双环饱和或部分不饱和杂环；或具有1到5个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的8元到10元双环杂芳基环；
环B是任选经取代的选自以下的基团：3元到7元饱和或部分不饱和碳环；8元到10元双环饱和或部分不饱和芳基环；具有1到4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的5元到6元单环杂芳基环；具有1到3个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的4元到7元饱和或部分不饱和杂环；具有1到5个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的7元到10元双环饱和或部分不饱和杂环；或具有1到5个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的8元到10元双环杂芳基环；
R1是弹头基团，其中R1在一位置处连接环A，所述位置不是相邻于连接W1的原子的原子；
Ry是卤素、-CN、-CF3、C1-4脂肪族基、C1-4卤代脂肪族基、-OR、-C(O)R或-C(O)N(R)2；
各R基团独立地为氢或任选经取代的选自以下的基团：C1-6脂肪族基、苯基、具有1到2个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的4元到7元杂环、或具有1到4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的5元到6元单环杂芳基环；
W1和W2各为-NR2-；
R2是氢、任选经取代的C1-6脂肪族基或–C(O)R；
m和p独立地为0到4；且
Rx在各情况下独立地选自-R、-OR、-O(CH2)qOR或卤素，其中q为1到4；以及
Rv在各情况下独立地选自-R、卤素、-OR、-O(CH2)qOR、–CN、–NO2、-SO2R、-SO2N(R)2、-SOR、-C(O)R、-CO2R、–C(O)N(R)2、-NRC(O)R、-NRC(O)N(R)2、-NRSO2R或-N(R)2，其中q为1到4。
7.一种式I-b化合物在制备用于治疗BTK介导的病症的药物中的用途，其中所述BTK介导的病症选自结肠直肠癌或胰腺癌，且所述式I-b化合物具有如下结构：
或其医药学上可接受的盐，其中：
环A是苯基；
环B是任选经取代的选自以下的基团：3元到7元饱和或部分不饱和碳环；8元到10元双环饱和或部分不饱和芳基环；具有1到4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的5元到6元单环杂芳基环；具有1到3个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的4元到7元饱和或部分不饱和杂环；具有1到5个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的7元到10元双环饱和或部分不饱和杂环；或具有1到5个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的8元到10元双环杂芳基环；
R1是弹头基团，其中R1在一位置处连接环A，所述位置不是相邻于连接W1的原子的原子；
Ry是卤素、-CN、-CF3、C1-4脂肪族基、C1-4卤代脂肪族基、-OR、-C(O)R或-C(O)N(R)2；
各R基团独立地为氢或任选经取代的选自以下的基团：C1-6脂肪族基、苯基、具有1到2个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的4元到7元杂环、或具有1到4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的5元到6元单环杂芳基环；
W1是–O-；
W2是-NR2-；
R2是氢、任选经取代的C1-6脂肪族基或–C(O)R；
m和p独立地为0到4；且
Rx在各情况下独立地选自-R、-OR、-O(CH2)qOR或卤素，其中q为1到4；以及
Rv在各情况下独立地选自-R、卤素、-OR、-O(CH2)qOR、–CN、–NO2、-SO2R、-SO2N(R)2、-SOR、-C(O)R、-CO2R、–C(O)N(R)2、-NRC(O)R、-NRC(O)N(R)2、-NRSO2R或-N(R)2，其中q为1到4。
8.根据权利要求7所述的用途，其中Ry是氟、溴或碘。
9.根据权利要求7所述的用途，其中Ry是-CN、-CF3、C1-4脂肪族基、C1-4卤代脂肪族基、-OR、-C(O)R或-C(O)N(R)2。
10.一种式I-b化合物在制备用于治疗BTK介导的病症的药物中的用途，其中所述BTK介导的病症选自结肠直肠癌或胰腺癌，且所述式I-b化合物具有如下结构：
或其医药学上可接受的盐，其中：
环A是任选经取代的选自以下的基团：3元到7元饱和或部分不饱和碳环；8元到10元双环饱和或部分不饱和芳基环；具有1到4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的5元到6元单环杂芳基环；具有1到3个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的4元到7元饱和或部分不饱和杂环；具有1到5个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的7元到10元双环饱和或部分不饱和杂环；或具有1到5个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的8元到10元双环杂芳基环；
环B是苯基；
R1是弹头基团，其中R1在一位置处连接环A，所述位置不是相邻于连接W1的原子的原子；
Ry是卤素、-CN、-CF3、C1-4脂肪族基、C1-4卤代脂肪族基、-OR、-C(O)R或-C(O)N(R)2；
各R基团独立地为氢或任选经取代的选自以下的基团：C1-6脂肪族基、苯基、具有1到2个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的4元到7元杂环、或具有1到4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的5元到6元单环杂芳基环；
W1是–O-；
W2是-NR2-；
R2是氢、任选经取代的C1-6脂肪族基或–C(O)R；
m和p独立地为0到4；且
Rx在各情况下独立地选自-R、-OR、-O(CH2)qOR或卤素，其中q为1到4；以及
Rv在各情况下独立地选自-R、卤素、-OR、-O(CH2)qOR、–CN、–NO2、-SO2R、-SO2N(R)2、-SOR、-C(O)R、-CO2R、–C(O)N(R)2、-NRC(O)R、-NRC(O)N(R)2、-NRSO2R或-N(R)2，其中q为1到4。
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